HPLC 法同時(shí)測(cè)定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量

承 晨，李 莉

常州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，常州213000

代代花，又名枳殼花、酸橙花、香櫞花，為蕓香科植物代代花Citrus aurantium L.var.amara Engl.的干燥花蕾，是藥食同源之品。其成熟果呈橙紅色，留于樹上至次年夏變?yōu)槲劬G色，狀如回生，故其果又名回青橙、回春橙?！按奔粗^其可回生續(xù)代。5～6 月花未開放時(shí)分批采摘，及時(shí)干燥。以完整、色黃白、香氣濃者為佳。主產(chǎn)于江蘇、浙江等省。味甘、微苦，平，歸肝、胃經(jīng)。具有理氣、寬胸、開胃的作用，主要用于胸脘脹悶、惡心嘔吐、食欲不振[1-3]。

代代花中含有豐富的揮發(fā)油和柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、構(gòu)椽皮素等黃酮類及N-甲基酪胺、辛弗林等生物堿成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)等藥理作用[4-6]。除有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其干花的揮發(fā)油進(jìn)行過(guò)研究外，而對(duì)黃酮類、生物堿成分的研究也僅局限于其果實(shí)枳殼[7，8]。為完善代代花的含量分析，保障藥材質(zhì)量，本文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）及Waters Empower 色譜工作站（美國(guó)沃特世公司）；XP105DR 十萬(wàn)分之一電子天平（美國(guó)Mettler 公司）。

1.2 藥品與試劑

5 批代代花購(gòu)于市場(chǎng)，分別產(chǎn)自徐州、常州、蘇州、南通，均經(jīng)江蘇省炮制規(guī)范修訂專家組（中國(guó)藥科大學(xué)余伯陽(yáng)教授、中山植物園徐增萊教授、江蘇省中醫(yī)院朱育鳳主任）鑒定確認(rèn)。

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林對(duì)照品（分別為： 批號(hào)110722-201613，純度94.3%；110721-201310，純度96.1%；111857-201102，純度99.6%；110727-201608，純度99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；冰醋酸、十二烷基硫酸鈉為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4.0 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；DAD 檢測(cè)器，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為20%乙腈水溶液（含0.08%十二烷基硫酸鈉的2.4%冰醋酸），梯度洗脫（0～15 min，0%～10%A；15～20 min，10%～60%A；20～25 min，60%～0%A）。檢測(cè)波長(zhǎng)：柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷為283 nm，辛弗林為275 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、辛弗林對(duì)照品適量，置于同一100mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為1.007、0.1049、2.940、0.1003mg·mL-1的對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL，置50mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。每1 mL 分別含柚皮苷0.1007mg、橙皮苷0.01049mg、新橙皮苷0.2940mg、辛弗林0.01003mg。冷藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取代代花細(xì)粉0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，加入50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液即得。

2.4 系統(tǒng)適用性與專屬性

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

（A）混合對(duì)照品色譜圖；（B）供試品色譜圖；（C）空白溶劑色譜圖1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.辛弗林

由圖1 可知，4 種成分色譜峰分離度良好（分離度>1.5），且均可通過(guò)DAD 純度檢測(cè)。方法專屬性良好。

2.5 線性與范圍

分別精密吸取“2.2”對(duì)照品貯備液1 mL 至2、5、10、20、50、100、200 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積值（Y）-進(jìn)樣濃度（X，mg·mL-1）進(jìn)行線性回歸（n=8），得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的回歸方程（相對(duì)偏差、線性范圍）分別為：Y=1.580×107X-2.771×104（r=1.000 0，5.035～1007 μg·mL-1）；Y=1.728×107X-978.1 （r=1.0000，0.5250～104.9μg·mL-1）；Y=1.852×107X-5.832×104（r=1.000 0，14.70～2940 μg·mL-1）；Y=4.025×106X-196.8 （r=0.999 8，0.502 0～100.3 μg·mL-1）。

2.6 定量限考察

將對(duì)照品儲(chǔ)備液用50%甲醇進(jìn)行多次等倍稀釋，信噪比S/N 為10 時(shí)，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林最低定量限分別為0.5035、0.5512、0.5250、0.502 μg·mL-1。

2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的峰面積RSD 值分別為0.2%、0.2%、0.1%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取1 批代代花（產(chǎn)地：蘇州，批號(hào)151014）6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法測(cè)定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的RSD 值分別為0.5%、0.7%、0.6%、0.7%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1 批代代花（產(chǎn)地：蘇州，批號(hào)151014），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、12、24、36、48 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件取10 μL 進(jìn)樣，測(cè)定各成分的峰面積。結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林峰面積的RSD 值分別為0.3%、0.5%、0.2%、0.5%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的代代花（產(chǎn)地：蘇州，批號(hào)151014）6 份，每份精密稱取50 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密加入柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林濃度分別為50.35、10.49、147、10.03 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液25 mL 及50%甲醇25 mL，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定其峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果見表1。

2.11 樣品測(cè)定

取5 批代代花，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法分別計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 代代花屬蕓香科植物酸橙的變種，參考《中國(guó)藥典》與枳實(shí)同屬，提取物代表成分為黃酮類的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和生物堿類的辛弗林，因此本研究同時(shí)使用上述對(duì)照品為指標(biāo)，對(duì)代代花的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)對(duì)水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等溶劑的考察，發(fā)現(xiàn)使用50%的甲醇作為溶劑，樣品的提取效率高，在對(duì)照品色譜圖中，色譜峰峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)高，分離效果好。通過(guò)考察超聲、回流等不同提取方法及提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)加入50%甲醇50 mL，加熱回流1 h，效果最佳，基本可以提取充分，且加樣回收試驗(yàn)也驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 樣品含量測(cè)定（n=3）

3.2 由于辛弗林屬于生物堿類物質(zhì)，極性較強(qiáng)，在一般液相條件下呈現(xiàn)極弱的保留，即使更換不同品牌、性質(zhì)的色譜柱（如Agilent 公司的ZORBAX SBC18、Poroshell 120；Waters 公司的XBridgeTM C18；島津公司的Inertsil ODS-SP；Thermo 公司的Syncronis C18）仍然得不到很好的分離。經(jīng)過(guò)摸索，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入0.1%十二烷基硫酸鈉，同時(shí)使用梯度洗脫可以使辛弗林的保留時(shí)間明顯延后，并且不影響柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的分離。在上述色譜柱上均可以使測(cè)定組分滿足分離要求。

3.3 根據(jù)4 種化合物紫外吸收波長(zhǎng)的差別，并參照《中國(guó)藥典》柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在283 nm、辛弗林在275 nm 有明顯吸收，且雜質(zhì)干擾少，故利用二極管陣列檢測(cè)器的實(shí)時(shí)掃描功能，獲得所有波長(zhǎng)下的色譜圖及即時(shí)的色譜圖，從而達(dá)到同時(shí)測(cè)定4種成分含量的目的。見圖2。

3.4 由于收集的樣品來(lái)自飲片市場(chǎng)，多見隔年貨或陳貨（該品為少用中藥），但是通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林不僅含量較高，而且含量相對(duì)穩(wěn)定，故可作為質(zhì)量控制的指標(biāo)。

圖2 紫外吸收光譜圖

3.5 近些年來(lái)，研究者對(duì)生物類黃酮進(jìn)行了大量的研究。其是自然界中存在的酚類物質(zhì)，屬植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性。代代花中含有的黃酮類含量高于同科其他植物，其中橙皮苷、柚皮苷具有抗炎作用；所含的生物堿主要是辛弗林、N-甲基酪胺等，是升高血壓、抗休克的主要有效成分。未來(lái)開展代代花在食療、治療抑郁及代代花茶飲品方面會(huì)有較大的發(fā)展空間，為綜合利用代代花的資源，很有必要對(duì)其開展深入系統(tǒng)性研究。