二陳湯加味對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1、內(nèi)皮素-1表達(dá)的影響

宋倩紅 李進(jìn)京 王俊月 李亮 牛賀 王肖艷 謝文英 包永生

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以不可逆的氣流受限為主要特征,其臨床發(fā)病率在我國逐年上升,已成為所有疾病中第3位的心理負(fù)擔(dān)和死因〔1,2〕。COPD對患者的負(fù)面心理情緒和近期感受到的心理敵意明顯高于其他正常人〔3〕，在目前的臨床治療方法中,常用藥物有糖皮質(zhì)激素、支氣管激素和舒張抑制劑等,只能近期暫緩其癥狀,遠(yuǎn)期的療效仍有待確認(rèn),且其耐藥性與不良反應(yīng)都是加重疾病患者的心理和精神負(fù)擔(dān)的重要原因〔4〕。二陳湯加味可以通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化損傷及炎癥反應(yīng)保護(hù)肺部氣道的結(jié)構(gòu)及有效發(fā)揮其遠(yuǎn)期的療效,減少了病人的發(fā)病時間和次數(shù)〔5～11〕。研究結(jié)果顯示許多COPD患者的沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)1表達(dá)與患者抗氧化細(xì)胞損傷及其代謝產(chǎn)物炎癥反應(yīng)呈明顯的負(fù)相關(guān),且Sirt1可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄直接發(fā)揮其顯著的抗炎作用,并激活內(nèi)皮素(ET)-1,而生長因子ET-1可直接增強(qiáng)平滑肌中細(xì)胞的正常增殖,能直接加重COPD患者平滑肌的細(xì)胞肥厚,以至肺血管壁因之增厚，并進(jìn)一步導(dǎo)致管腔狹窄,使血管功能衰減〔12～15〕。本實(shí)驗(yàn)觀察二陳湯加味對COPD大鼠模型肺組織中Sirt1、ET-1蛋白表達(dá)的影響，探討其藥效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物與飼料 SD大鼠50只，雄性，SPF級，7～8周齡， 體重(200±20)g(由濟(jì)南朋悅公司提供)；合格證編號SYXK(豫)2012-0009(由河南省中醫(yī)研究院動物實(shí)驗(yàn)中心提供)；生長飼料，許可證號：蘇飼證(2014)01008(由江蘇協(xié)同有限公司提供)。倫理審查批準(zhǔn)編號DWLL20130018。

1.2藥物及試劑 二陳湯加味的組成：茯苓20 g(批號1509006W)，陳皮10 g(批號 1509002S)，枳殼10 g(批號1510002W)，半夏10 g(批號 1501001S)，地龍10 g(批號1511002 S)，山藥20 g(批號 1509003S)，黨參25 g(批號 1511003W)，葶藶子15 g(批號 1510001S)，白術(shù)15 g(批號 1510004 S)，桂枝3 g(批號 1510002S)，杏仁10 g(批號 1512002S)，炒蘇子20 g(批號1512001S)，炙麻黃6 g(批號 1509001S)。以上藥物均由華潤三九醫(yī)藥公司提供，為中藥配方顆粒。兔抗大鼠Sirt一抗(三鷹Proteintech中國分公司，批號13161-1-AP)。脂多糖(LPS，美國SIGMA公司，批號025M40400V)。小鼠單克隆抗體ET-1(Abcam，批號GR270664-3)。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德公司，批號11I18B22)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊公司，批號119041)。總RNA提取試劑盒(南京諾唯贊公司，批號086001)。

1.3儀器 全自動染色機(jī)(ST5020)、半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245)、自動組織脫水處理機(jī)(TP1020-1，徠卡上海分公司)。BX51+CCD全自動病理圖像采集和分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)。生物顯微鏡、顯微攝影儀(麥克奧迪公司，BA210)。inspira呼吸機(jī)(日本光電公司)。TopScan肺功能測量系統(tǒng)(吉安德爾公司)。實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Applied biosystem公司)。

1.4動物造模及分組給藥 50只大鼠分為正常組、二陳湯加味低、中、高劑量組、模型組，每組10只。制備COPD的大鼠模型〔16～20〕如下：將需造模的40只SD大鼠置于自制透明且封閉的煙薰箱內(nèi)煙薰，每次以香煙10支進(jìn)行煙熏實(shí)驗(yàn)，持續(xù)30 min，2次/d。分別于第1、13日，對需造模的大鼠氣管內(nèi)注入LPS (1 mg/ml)0.2 ml，而正常組則注入等量生理鹽水。完成造模實(shí)驗(yàn)后〔15〕，對造模組灌胃治療，二陳湯加味低、中、高劑量組分別以10、20、40 g/(kg·d)給藥，時間為10點(diǎn)和16點(diǎn)，灌胃分別各一次，每次3 ml。正常與模型組則注入等體積生理鹽水，且稀釋度亦為6 ml/d，持續(xù)給藥14 d。

1.5大鼠一般狀況觀察 體量增減、毛皮色澤變化、食量狀況及鼻腔分泌物，并及時更新跟進(jìn)研究過程，出現(xiàn)死亡時，探明其死因，并做好跟蹤記錄。

1.6大鼠肺功能檢測 大鼠COPD氣道重塑持續(xù)發(fā)病時，勢必誘發(fā)肺功能持續(xù)抑制，肺功能測定作為COPD的最重要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。檢測具體操作為，每只大鼠將分別置于與感應(yīng)器相連接的體積描記箱中，計(jì)算出潮氣量(VT)和呼氣峰流速〔20〕。

1.7免疫組化法檢測ET-1、Sirt1的蛋白表達(dá) 切片脫蠟，使用3%的過氧化氫進(jìn)行封閉，抗原修復(fù)完成后采用5%的牛血清蛋白(BSA)液進(jìn)行封閉，并滴加一抗ET-1、Sirt1工作液，再滴加山羊抗免疫球蛋白(Ig)G二抗，DAB顯色，復(fù)染。陽性片陽性對照，磷酸鹽緩沖液陰性對照。免疫組化表現(xiàn)為陽性之根據(jù)是棕黃色的肺組織鏡下觀。每組的免疫組化切片，隨機(jī)選取其中的6個高倍鏡視野，使用顯微鏡圖像分析軟件(IPP)，計(jì)算陽性顯色的平均光密度值，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

1.8實(shí)時熒光定量PCR法檢測ET-1、Sirt1的mRNA表達(dá) 將研碎肺組織置于PE管中，并加組織裂解液與氯仿萃取劑，在混勻之后，采取多次離心的方法，并在提取以及洗脫之后，以總RNA提取試劑盒提取肺組織中總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Sirt-1引物：上游5′-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3′，下游5′-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3′；ET-1引物：上游5′-TCTTCTCTCTGCTGTTTGTG-3′，下游5′-TAGTTTTCTTCCCTCCACC-3′,GAPDH：上游 5′-AGGGCTGTTCGTGAGCACA-3′，下游 5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′，然后計(jì)算各組 Sirt1 mRNA 相對表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS21.0進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)或方差分析。

2 結(jié) 果

2.1健康情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，正常組狀態(tài)較為良好，且動作十分敏捷，無各種異常及死亡發(fā)生。模型組體重與造模之前相較則明顯降低，毛枯皮槁，精靡神萎，呼吸頻率明顯加快，鼻腔可見不等的分泌物，且死亡2只。治療各組相較于模型組有整體的改善。其中低劑量組與造模前相較，體重整體下降，且死亡1只。高、中劑量組體重較前整體呈增長趨勢，無死亡。

2.2肺功能影響 與正常組相比，模型組TV及呼氣流量峰值(PEF)均顯著抑制(P<0.01)；與模型組相較，二陳湯加味各個劑量組TV、PEF均顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.3肺組織Sirt1、ET-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響 細(xì)胞核鏡下的棕黃色顆粒為Sirt1的陽性表達(dá)，部位主要為巨噬細(xì)胞核及支氣管上皮細(xì)胞胞核；陽性表達(dá)的ET-1在鏡下可見細(xì)胞質(zhì)中含有棕黃色的顆粒，部位表達(dá)為肺泡壁、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞質(zhì)；正常組表達(dá)為陰性或弱陽性(圖1)。與正常組比較，模型組Sirt1的蛋白和mRNA表達(dá)顯著抑制(P<0.01)；與模型組比較，二陳湯加味低、中、高劑量組Sirt1的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與正常組比較，模型組ET-1的蛋白和mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組相較，各劑量組ET-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組肺功能、肺組織Sirt1、ET-1蛋白和mRNA表達(dá)

圖1 各組肺組織Sirt1、ET-1蛋白表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

COPD的疾病特征為持續(xù)發(fā)展進(jìn)行性氣流受限，伴有害氣體或顆粒所致的肺和氣道的慢性炎癥反應(yīng)增加，從而誘使患者的肺功能進(jìn)行性下降，具有高度的致殘性，甚至部分患者會因之而喪失部分勞動能力〔21〕。其中氣道重塑持續(xù)在 COPD 的整個發(fā)病過程，亦為COPD氣流受限呈不可逆的主要病理基礎(chǔ)〔22〕。雖然西藥能在一定程度上對癥狀起到緩解作用，減少其并發(fā)癥，但由于COPD 的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的各種防治措施對患者肺功能持續(xù)惡化的阻止作用仍顯不足，尚不能從根本上改變COPD患者的肺功能持續(xù)下降趨勢，且藥物治療多存在程度不等的毒副作用。

中醫(yī)將 COPD 歸屬為肺脹、咳嗽、痰飲等范疇，肺主氣，司呼吸，外邪侵襲，肺失宣降，久之則痰瘀膠結(jié)，伏于肺絡(luò)，阻塞氣道成為“宿根”，損傷正氣〔23〕。因此COPD的治療當(dāng)以祛痰與健脾兼治，并結(jié)合患者的臨床辨證，隨癥加減。而二陳湯具有燥濕化痰、理氣和中的功效，乃祛痰之通劑〔24〕，始見于宋代《太平惠民和劑局方》。選用二陳湯加味治COPD，方中既有半夏、陳皮、茯苓之燥濕化痰、理氣和中，又有黨參、白術(shù)、山藥之健脾益氣扶正，再稍佐麻黃、桂枝、杏仁、蘇子等宣肺散寒、化痰平喘，全方標(biāo)本兼顧，扶正以祛邪，在臨床上取得較好的療效。

細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)所誘發(fā)的慢性炎癥與COPD的發(fā)病息息相關(guān)。研究表明，Sirt1可以通過與不同的靶蛋白結(jié)合，以響應(yīng)細(xì)胞外刺激，進(jìn)而參與COPD的發(fā)生進(jìn)展〔25〕。馬南等〔26〕研究證實(shí)Sirt1具有對炎癥反應(yīng)的抑制作用，可為治療COPD提供有意義靶點(diǎn)。杜強(qiáng)等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)Sirt1表達(dá)降低可能是導(dǎo)致COPD風(fēng)險增高的重要因素。黃紅銘等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)益肺膠囊可能通過上調(diào)Sirt1蛋白濃度以顯著提升患者的肺功能，進(jìn)而治療COPD。而ET-1是一種內(nèi)源性血管收縮因子，肺是ET-1作用最敏感的靶器官，研究表明〔29〕ET-1 廣泛參與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，具有重要的生理功能。ET-1可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶動態(tài)平衡及炎癥、氧化應(yīng)激過程參與肺氣腫的病理機(jī)制，從而上調(diào)在 COPD 患者中的表達(dá)量〔30〕。ET-1 還可以通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞的黏附作用，從而加重炎癥反應(yīng)〔31〕。而ET-1的興奮可作用在平滑肌細(xì)胞，促使肺血管增殖肥厚，誘發(fā)血管重建〔32〕。因此，ET-1與Sirt1對COPD病程進(jìn)展中的炎癥反應(yīng)及氧化損傷、血管結(jié)構(gòu)重建有著重要作用。