2-溴棕櫚酸鞘內(nèi)給藥對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠疼痛的作用及機(jī)制*

王煜嘉，張 鳳，王柏軍，謝 敏

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 湖北 437100)

骨癌痛(bone cancer pain，BCP)是腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時(shí)最常見癥狀之一，是一種包括炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛及腫瘤特異性機(jī)制的特殊病理性疼痛[1]。BCP的主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)進(jìn)行性背景痛、爆發(fā)痛及痛覺過敏[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，線粒體分裂異常是骨癌痛發(fā)生和維持的重要因素，線粒體分裂-融合動(dòng)態(tài)平衡的維持在線粒體功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且參與突觸可塑性調(diào)控、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、介導(dǎo)神經(jīng)元之間信息傳遞以及膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎性介質(zhì)釋放。線粒體分裂由動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)介導(dǎo)。正常生理狀態(tài)下，Drp1大量分散在細(xì)胞溶質(zhì)中，只有小部分集中于線粒體；病理狀態(tài)下，Drp1轉(zhuǎn)移至線粒體膜偶聯(lián)GTP水解促進(jìn)線粒體膜收縮啟動(dòng)分裂[5]。Drp1表達(dá)及磷酸化(p-Drp1)上調(diào)導(dǎo)致線粒體分裂異常進(jìn)而引起線粒體片段化及功能不全，從而對(duì)細(xì)胞功能和活性造成負(fù)面影響[6]。2-溴棕櫚酸(2-BP)是一種不可逆的蛋白棕櫚酰化抑制劑，它能阻斷棕櫚酸鹽與蛋白質(zhì)的結(jié)合，影響蛋白質(zhì)在膜結(jié)構(gòu)上的定位從而影響其功能[7]。本研究探討了2-BP鞘內(nèi)給藥對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠疼痛的作用，并探討其可能的機(jī)制，從而為鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)中使用的Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，160～200g，6～8周齡。

大鼠乳腺癌MRMT-1細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

二甲基亞砜(DMSO)、2-BP、蛋白酶抑制劑cocktail均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，加強(qiáng)型RIPA lysis buffer、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L，A0208)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、100×青霉素+鏈霉素混合液P/S均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，anti-Drp1(A0127)、anti-rabbit-β-actin(A1978)均購(gòu)自中國(guó)ABclonal公司，rabbit anti-pSer47-Drp1(PA5-17391)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 模型建立及分組處理

將SD大鼠(18只)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和2-BP組(6只/組)。模型組和2-BP組均建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型，方法如下[8]：將大鼠乳腺癌MRMT-1細(xì)胞置于含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、2% 青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集細(xì)胞并重懸于HBSS緩沖液。模型組和2-BP組采用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，剃毛消毒；脛骨上半部分開口，用微量注射器將10 μL MRMT-1細(xì)胞懸液(含3×105個(gè)細(xì)胞)注射到左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)，骨蠟封口。假手術(shù)組注射相同體積HBSS緩沖液。將2-BP溶解在DMSO中，使用前用生理鹽水按體積比1∶1進(jìn)行稀釋，調(diào)整濃度為20mmol/L。建模12d后，2-BP組剃除注射部位毛發(fā)并進(jìn)行皮膚表面消毒，用無(wú)菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突間隙垂直進(jìn)針，當(dāng)出現(xiàn)空洞感時(shí)證明注射器已進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，將注射器由垂直緩慢傾斜至45°；根據(jù)體質(zhì)量單次注射2-BP 1.0 mg/kg，注射完畢后緩慢取出微量注射器，輕輕按住注射部位1～2 min。模型組與假手術(shù)組注射相同體積DMSO+生理鹽水(體積比1∶1)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 50%縮足閾值(PWT)檢測(cè)

各組給藥后0、1、3、6和24h，將大鼠置于5mm×5mm金屬絲網(wǎng)地板上，讓其安靜30min后用von Frey纖維(Stoelting，Wood Dale，IL，USA，范圍從0.4g至26.0g)對(duì)后足部中間進(jìn)行機(jī)械刺激。采用up-down法確定50% PWT值。簡(jiǎn)而言之，校準(zhǔn)后的單纖維絲垂直應(yīng)用于足底表面，直到纖維絲彎曲即可，每相鄰的兩次刺激之間間隔2min。平靜狀態(tài)下動(dòng)物在受到刺激后出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。當(dāng)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，需用相鄰較低一級(jí)力度的Von Frey纖維進(jìn)行刺激；當(dāng)出現(xiàn)陰性反應(yīng)時(shí)，需用相鄰較高一級(jí)力度的Von Frey纖維進(jìn)行刺激。在出現(xiàn)與前一次測(cè)試反應(yīng)不一致的測(cè)試結(jié)果時(shí)開始計(jì)數(shù)(連同反應(yīng)出現(xiàn)變化前的一次測(cè)試在內(nèi))，記錄6次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測(cè)。50%PWT(g)=(10[Xf+Kδ])/10000，Xf為本次行為學(xué)測(cè)試中使用的最后一個(gè)Von Frey纖維的階數(shù)，K為痛覺閾矯正系數(shù)(可查表獲得)，δ為相鄰不同纖維刺激之間的差異，即0.224[9]。

1.4.2 檢測(cè)脊髓組織Drp1、p-Drp1表達(dá)

各組給藥后24h，給予過量麻醉(戊巴比妥鈉50mg/kg)處死，用眼科剪從中間分離脊柱，暴露脊髓，用解剖剪剝離脊膜，得到完整的脊髓，分離腰段脊髓。加入含有酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿組織，4℃條件下10000r/min離心15min；取上清，加入三分之一體積的4×上樣緩沖液，沸水浴加熱10min，BCA蛋白分析試劑盒檢測(cè)上清中的蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉在室溫下封閉1h，TBST洗膜5min×3次。4℃條件下分別加入Drp1、p-Drp1一抗(稀釋比例均為1∶1000)，β-actin一抗(稀釋比例為1∶5000)，孵育過夜。加入二抗，室溫孵育1h。TBST緩沖液洗膜3次，Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，ImageJ軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算Drp1、p-Drp1蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-Drp1/Drp1。

1.4.3 采用ELISA法檢測(cè)脊髓組織TNF-α表達(dá)

取各組大鼠腰段脊髓組織，使用含有蛋白酶抑制劑混合物的PBS緩沖液(pH值為7.4)進(jìn)行勻漿，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各100μL加入孔中，37℃條件下反應(yīng)90min。棄液后按每孔100μL依次加入抗TNF-α抗體工作液，37℃條件下反應(yīng)60min。洗滌后每孔加入100μL ABC工作液，37℃條件下反應(yīng)30min。洗滌后每孔加入90μL TMB顯色液，37℃條件下反應(yīng)25～30min，每孔100μL依次加入TMB終止液。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 2-BP鞘內(nèi)給藥降低BCP大鼠機(jī)械痛敏感性

與假手術(shù)組比較，模型組給藥(溶劑)后0、1、3和6h的50% PWT均降低，2-BP組給藥后0、1、3和6h的50% PWT均降低，其中0和1h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與模型組比較，2-BP組給藥(2-BP)后1、3和6h的50% PWT均升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組給藥后50% PWT比較

2.2 2-BP鞘內(nèi)給藥減弱Drp1-GTPase活性

與假手術(shù)組比較，模型組脊髓組織Drp1表達(dá)上調(diào)、p-Drp1表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；2-BP組脊髓組織Drp1表達(dá)低于模型組，但高于假手術(shù)組、p-Drp1表達(dá)高于模型組，但低于假手術(shù)組(P<0.05)，見表2，圖1。

圖1 免疫印跡分析各組脊髓組織中Drp1和p-Drp1蛋白表達(dá)水平

2.3 2-BP鞘內(nèi)給藥抑制脊髓炎癥

采用ELISA法檢測(cè)脊髓組織TNF-α表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組脊髓組織中TNF-α表達(dá)上調(diào)，2-BP組TNF-α表達(dá)低于模型組，但高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組脊髓組織Drp1、p-Drp1、TNF-α表達(dá)比較

3 討 論

本研究以骨癌痛大鼠模型為研究載體，探究2-BP對(duì)動(dòng)物痛覺行為的影響以及相關(guān)機(jī)制。2-BP參與多種痛覺的調(diào)控，在神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠模型中，鞘內(nèi)注射2-BP可顯著緩解神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏[10]；在慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫(CCD)大鼠模型中，2-BP鞘內(nèi)注射可顯著減緩動(dòng)物的熱痛覺過敏和機(jī)械性痛覺過敏，同時(shí)下調(diào)NR2B棕櫚?；痆11]。在本研究中，通過對(duì)骨癌痛大鼠給藥(2-BP)前后的痛覺行為分析表明，鞘內(nèi)注射可顯著改善動(dòng)物的痛覺行為表現(xiàn)。本研究結(jié)果不僅在新的痛覺模型中證明了2-BP具有鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)也為2-BP在痛覺調(diào)節(jié)中的作用提供了新的研究基礎(chǔ)。

線粒體生物學(xué)功能正常與否與動(dòng)物的痛覺行為密切相關(guān)，主要體現(xiàn)在線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控。線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1在痛覺模型中被證明表達(dá)量上調(diào)，如慢性收縮損傷模型(CCI)[12]；抑制或下調(diào)Drp1的表達(dá)可顯著降低化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型動(dòng)物的痛覺行為[13]。Drp1的棕櫚?；谡{(diào)節(jié)線粒體生物活性中起關(guān)鍵作用[14]。Drp1的S-棕櫚?；梢员蛔貦磅ｕ；D(zhuǎn)移酶(PAT)ZDHHC13調(diào)控，在ZDHHC13缺陷小鼠中，Drp1中S-棕櫚?；癄顟B(tài)較低，線粒體動(dòng)力學(xué)紊亂[15]。該結(jié)果提示，S-棕櫚?；途€粒體融合/分裂動(dòng)力學(xué)之間具有相關(guān)性。2-BP通過抑制DHHC PATs發(fā)揮棕櫚?；种苿┑淖饔枚{(diào)節(jié)。本研究顯示，骨癌痛模型動(dòng)物脊髓組織中Drp1的總蛋白和p-Drp1水平均表達(dá)異常，2-BP處理后部分恢復(fù)了Drp1的表達(dá)和p-Drp1。通過總結(jié)上述結(jié)果表明，2-BP可能通過調(diào)節(jié)特定線粒體蛋白的棕櫚?；绊懢€粒體功能，進(jìn)而改善疼痛誘導(dǎo)動(dòng)物的疼痛行為。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在骨癌痛模型動(dòng)物中表達(dá)上調(diào)，而2-BP處理后TNF-α含量下調(diào)。另有研究顯示[10]，在神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠模型中，TNF-α介導(dǎo)了特定蛋白的棕櫚酰化修飾，從而在痛覺調(diào)控中發(fā)揮作用。據(jù)此推測(cè)，本研究中，骨癌痛動(dòng)物Drp1的表達(dá)和修飾異?？赡芘cTNF-α的異常調(diào)節(jié)相關(guān)，但是，二者之間具體的作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，2-BP鞘內(nèi)給藥可減緩乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠的疼痛行為，其機(jī)制可能與激活脊髓線粒體Drp1活性及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。