30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑高效液相色譜分析

曹志秀，馬 超，張力卜，段小莉，李佳浩，張彥輝，徐 軍，2*，陳 昶，2*

（1.河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193）

咪鮮胺（prochloraz）是一種咪唑類廣譜殺菌劑，通過干擾菌體麥角甾醇的生物合成過程中的C14脫甲基反應(yīng)而發(fā)揮作用[1]，尤其對由子囊菌和半知菌引起的多種作物病害防效顯著，可用于治療和鏟除由核盤菌屬、鐮孢屬及白粉菌、炭疽菌等多種致病菌引起的油料作物、谷類、水果、蔬菜及經(jīng)濟作物的病害[2]，其高防效、高穩(wěn)定性及作物安全性受到了農(nóng)民的青睞。

氟環(huán)唑（epoxiconazole）是一類兼具保護和治理作用的新一代三唑類殺菌劑，具有較強的內(nèi)吸性[3]，可迅速被植株吸收并傳導(dǎo)至感病部位，阻止病害的侵染，其作用機理是通過抑制病菌麥角甾醇的合成，從而阻礙病菌細(xì)胞壁的形成致使病菌死亡[4]。該藥不僅有良好的鏟除活性，持效性長[5-6]，還有誘導(dǎo)作物提高自身抗病性的作用[7]。

咪鮮胺和氟環(huán)唑進行復(fù)配可以提高藥效，抑制由單一類型殺菌劑導(dǎo)致的抗病性的發(fā)展。30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑（商品名：鮮行者）是一種新型復(fù)配殺菌劑，能有效防治水稻紋枯病。目前關(guān)于咪鮮胺和氟環(huán)唑單劑的檢測方法國內(nèi)外已有諸多報道，其中咪鮮胺單劑主要分析方法有HPLC[2]、GC-ECD和LC-MS/MS[8]，氟環(huán)唑單劑主要分析方法有HPLC[9]、GC（ECD或NPD）和LC-MS/MS[10-11]，但是兩者復(fù)配制劑30%咪鮮胺·氟環(huán)唑微乳劑的分析方法尚未見報道。筆者采用反相高效液相色譜法，使用外標(biāo)法同時測定30%咪鮮胺·氟環(huán)唑微乳劑中2種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，供相關(guān)人員參考。

1 試劑及儀器

1.1 試劑

甲醇（色譜級），默克（德國）股份兩合公司；乙腈（色譜級），飛世爾科技公司；水（新蒸二次蒸餾水）；咪鮮胺標(biāo)樣（已知含量不小于98%）和氟環(huán)唑標(biāo)樣（已知含量不小于98%），沈陽化工研究院；30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑（20%咪鮮胺＋10%氟環(huán)唑），河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀和2489 UV-Vis檢測器，沃特世科技（上海）有限公司；UV-6100紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；0.45 μm孔徑的有機過濾器，天津科億隆實驗設(shè)備有限公司；濾膜，上海密粒膜分離技術(shù)有限公司。

1.3 色譜操作條件

色譜柱為Inert Sustain C18Column不銹鋼柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）；流動相為V甲醇∶V乙腈∶V水=30∶40∶30，經(jīng)濾膜過濾，并進行脫氣；柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225 nm，進樣量為5 μL。

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

分別稱取咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g（純度為98.7%，精確至0.000 2 g）和氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g（純度為98.7%，精確至0.000 2 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40 mL甲醇，利用超聲波處理5 min，待標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解后定容并上下顛倒搖勻，制得咪鮮胺質(zhì)量濃度約為1 mg/mL、氟環(huán)唑質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL的標(biāo)樣溶液，進行過濾后存于4℃冰箱待測。

稱取含咪鮮胺0.05 g和氟環(huán)唑0.025 g的試樣（精確至0.000 2 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40mL甲醇，利用超聲波處理15 min，待試樣完全溶解后定容并上下顛倒搖勻，制得質(zhì)量濃度約為5 mg/mL的試樣溶液，進行過濾后存于4℃冰箱待測。

2.2 測定

用1.3中檢測試樣有效成分的檢測條件長時間地平衡C18色譜柱和檢測儀器，觀察檢測器響應(yīng)值的波動情況直到其持續(xù)呈現(xiàn)一條直線并無噪音干擾時（基線波動范圍應(yīng)小于10-3），用標(biāo)樣溶液測試有效成分峰面積的相對偏差（應(yīng)小于1.5%），待色譜柱及儀器達(dá)到最佳檢測狀態(tài)，檢測誤差符合檢測標(biāo)準(zhǔn)時，取2.1中配制好的標(biāo)樣溶液和試樣溶液進行測定。

2.3 計算

試樣中有效成分咪鮮胺或氟環(huán)唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w（%）按式（1）進行計算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中咪鮮胺（或氟環(huán)唑）峰面積的平均值，mAU；A2為試樣溶液中有效成分咪鮮胺（或氟環(huán)唑）檢測峰面積的平均值，mAU；m1為咪鮮胺（或氟環(huán)唑）標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；P為咪鮮胺（或氟環(huán)唑）標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 檢測波長的判定

分別對咪鮮胺和氟環(huán)唑標(biāo)樣溶液進行全波長掃描，獲得了兩者的紫外吸收光譜（圖1）。在205 nm和203 nm處，咪鮮胺和氟環(huán)唑的吸光度較高，但在實際檢測中，采用較低檢測波長時，靈敏度不佳。因此，本方法最終選定225 nm作為檢測波長，此處兩者均有較強吸收，且雜質(zhì)影響較小。

圖1 氟環(huán)唑和咪鮮胺紫外全波長掃描圖

3.2 流動相的選擇

在30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測中，通過不斷地調(diào)整流動相中甲醇、乙腈和水的配制比例，觀察峰型變化和出峰快慢，依次對多種不同比例的流動相進行篩選。最終檢測結(jié)果表明，當(dāng)甲醇、乙腈、水的體積比為30∶40∶30時，分離效果最佳，色譜峰峰形尖銳，出峰時間短，滿足分析要求（圖2、圖3）。此外由于試樣由溶劑、助劑和有效成分配制而成，在試樣溶液的液相色譜圖（圖3）中，2.911min左右出現(xiàn)助劑峰，但與有效成分的峰之間分離效果良好，不影響檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。

圖2 標(biāo)樣液相色譜圖

圖3 30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑的液相色譜圖

3.3 分析方法的線性關(guān)系

稱取一定質(zhì)量的咪鮮胺和氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的咪鮮胺母液和質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的氟環(huán)唑母液于4℃冰箱保存。依次吸取咪鮮胺母液1.0、1.25、2.5、5.0、7.5mL進行稀釋，制得0.20～2.0 mg/mL的一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液；依次吸取氟環(huán)唑母液1.0、1.25、2.5、5.0、7.5 mL進行稀釋，制得0.10～1.0 mg/mL的一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液。之后用1.3的實驗操作條件對各質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液進行測定并記錄各針的檢測峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到咪鮮胺和氟環(huán)唑的線性方程。結(jié)果表明咪鮮胺和氟環(huán)唑均具有良好的線性關(guān)系，咪鮮胺的回歸方程為y=13 009.06 x＋193 422.30，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9；氟環(huán)唑的回歸方程為y=9 818.05 x＋43 258.51，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4（圖4、圖5）。

圖4 咪鮮胺線性關(guān)系圖

圖5 氟環(huán)唑線性關(guān)系圖

3.4 分析方法的精密度

在上述色譜檢測條件下，對30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑試樣重復(fù)進行5次獨立測試，有效成分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于2（1-0.5logC）×0.67，其中C為樣品中有效成分含量，以小數(shù)計[12]。由檢測結(jié)果可見，試樣中咪鮮胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.57%（＜1.711），氟環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%（＜1.890），均符合分析要求（n=5）。因此該分析方法的精密度良好（表1）。

表1 方法精密度測定結(jié)果（n=5）

3.5 分析方法的準(zhǔn)確度

稱取5份含咪鮮胺0.05 g和氟環(huán)唑0.025 g的已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣，再分別加入咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品（約0.05 g）和氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品（約0.025 g），對其有效成分含量進行測定，計算回收率，檢測結(jié)果見表2。咪鮮胺（100.09%）和氟環(huán)唑（99.94%）的平均回收率均較高，符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

表2 分析方法的回收率測定結(jié)果（n=5）

4 結(jié) 論

本文針對30%咪鮮胺·氟環(huán)唑微乳劑建立了可以同時檢測有效成分咪鮮胺和氟環(huán)唑的高效液相色譜分析方法，并對此方法進行了方法驗證，結(jié)果表明咪鮮胺和氟環(huán)唑均具有良好的線性關(guān)系，分離效果較好，檢測結(jié)果重現(xiàn)性良好，精密度較高，回收率均達(dá)到了99%以上，方法準(zhǔn)確度較高，且簡單高效易操作，因此該方法可用于產(chǎn)品質(zhì)量檢測，具有很強的可行性和實際應(yīng)用價值。