5種南藥植物提取物對(duì)致病疫霉的抑制作用

王紅剛，陳銀華，林 江，耿夢(mèng)婷，張 瑞，邱煜榮，王文橋

（1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海口 570228；2.海南大學(xué)林學(xué)院，海口 570228；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北保定 071000）

致病疫霉［Phytophthora infestans（Mont.）de Bary］引起的晚疫病是番茄生產(chǎn)中的重要病害[1]，主要依靠化學(xué)農(nóng)藥防治。由于致病疫霉對(duì)現(xiàn)用內(nèi)吸性殺菌劑甲霜靈、霜靈等產(chǎn)生抗性使藥效降低[2]，化學(xué)殺菌劑超量使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)[3]，所以利用植物中豐富多樣的天然抗性成分及對(duì)天然產(chǎn)物模擬開發(fā)新型殺菌劑已成為農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑和方法[4]。據(jù)報(bào)道，五倍子、菊科植物旋覆花、知母等藥用植物提取物對(duì)致病疫霉有較好的抑菌活性[5-7]。

南藥指長(zhǎng)江以南的熱帶、亞熱帶地區(qū)，傳統(tǒng)指廣東、海南、廣西、福建南部、臺(tái)灣、云南所產(chǎn)的地道藥材[8]。海南省南藥資源豐富，在進(jìn)行植物抗性物質(zhì)篩選研究方面具有資源優(yōu)勢(shì)。研究報(bào)道，幾種南藥植物提取物有一定的殺蟲和除草活性[9-10]。多種南藥植物提取物對(duì)香蕉炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、番石榴擬盤多毛孢等病原菌的抑菌活性較高[11-17]，目前尚未見南藥提取物及其分離組分對(duì)致病疫霉活性的相關(guān)研究報(bào)道。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，選用了5種有抑菌活性的南藥植物，測(cè)試了乙醇提取物對(duì)致病疫霉的活性，并對(duì)抑菌活性較高的九里香粗提物初步分離后測(cè)定分離組分的抑菌活性，旨在明確5種南藥植物粗提物及其中九里香粗提物分離組分對(duì)致病疫霉的抑制作用，為南藥資源抗菌活性物開發(fā)利用和植物病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物提取物

九里香（Murraya paniculata）、陰香（Cinnamomum burmanni）、黃 皮（Clausena lansium）、胡 椒（Piper nigrum）、檳榔（Areca catechu），采自海南大學(xué)儋州校區(qū)及附近農(nóng)場(chǎng)，采集部位均為葉片，經(jīng)海南大學(xué)植物學(xué)學(xué)科羅麗娟教授鑒定為所需供試材料，陰干粉碎得干粉，過(guò)40目篩。

1.1.2 供試菌株

致病疫霉（Phytophthora infestans），從海南省昌江黎族自治縣烏烈鎮(zhèn)烏烈村采集番茄晚疫病病葉，分離純化后得到菌株CJ-13，通過(guò)顯微鏡觀察菌絲和孢子囊形態(tài)并由河北省農(nóng)科院植保所王文橋研究員鑒定為所需供試菌株。保存于10℃、試管中RSA培養(yǎng)基（黑麥60 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL）斜面上，從試管中RSA培養(yǎng)基斜面上挑取菌絲體轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)皿中RSA培養(yǎng)基平板上，置于18℃條件下培養(yǎng)活化，用于抑菌活性測(cè)定；在培養(yǎng)菌株CJ-13的RSA培養(yǎng)基平板上加入無(wú)菌水，用滅菌毛刷刷取菌絲，兩層紗布過(guò)濾，將孢子囊懸浮液接種于易感晚疫病的番茄（品種“玉女”）離體葉片上，18℃保濕培養(yǎng)4 d，將葉片上產(chǎn)生的孢子囊用于測(cè)定南藥提取物的抑菌活性。

1.1.3 供試植物

花盆中種植“玉女”番茄幼苗，1株/盆，每月施由45%復(fù)合肥（N∶P2O5∶K2O）配制的0.2%營(yíng)養(yǎng)液2次，待植株長(zhǎng)至5片復(fù)葉后用于盆栽植株試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 5種南藥植物粗提物浸膏的制備和九里香粗提物初分離

參照王紅剛等[18]的方法，將5種供試干粉分別用95%乙醇提取2次，合并提取液并濃縮得到浸膏。九里香粗提物浸膏加蒸餾水懸浮，順次用極性由低到高的4種溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取，減壓濃縮得到5種萃取組分浸膏。

1.2.2 室內(nèi)毒力和防治效果測(cè)定方法

5種南藥植物粗提物浸膏以95%乙醇溶解并配置200 mg/mL的最高質(zhì)量濃度，倍量稀釋為8個(gè)系列質(zhì)量濃度稀釋液；萃取組分設(shè)置最高質(zhì)量濃度100 mg/mL，倍量稀釋得到7個(gè)質(zhì)量濃度。

菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定系列濃度稀釋液對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性。在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中RSA培養(yǎng)基平板表面加入稀釋液，每皿0.27 mL，每處理3皿，對(duì)照加等量95%乙醇，用玻璃涂棒涂勻，揮干后，于平板中央接種致病疫霉直徑0.5 cm的菌餅，每皿1個(gè)，蓋上培養(yǎng)皿蓋并用Parafilm膜密封。放于18℃培養(yǎng)箱5～6 d，直尺十字交叉測(cè)量培養(yǎng)皿中菌落直徑，計(jì)算抑制率。

按照王樹桐等[7]的方法測(cè)定供試稀釋液對(duì)供試病菌休止孢萌發(fā)的抑制作用。制備含系列濃度稀釋液的RSA培養(yǎng)基平板，對(duì)照加等量95%乙醇，溶劑揮干。孢子囊10℃下放置3 h，用蒸餾水稀釋得到所需休止孢懸浮液，于含藥平板展勻（0.1mL/皿）。18℃培養(yǎng)24 h，10×10倍鏡檢總數(shù)和萌發(fā)數(shù)，每處理4皿，每皿10視野。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為芽管直徑比休止孢直徑長(zhǎng)。計(jì)算萌發(fā)率和稀釋液對(duì)休止孢萌發(fā)的抑制率。

采用離體葉片法[19]測(cè)定稀釋液對(duì)致病疫霉休止孢侵染離體葉片的抑菌活性。在Potter 噴霧塔1.03×105Pa的壓力下將稀釋液噴于大小一致的番茄葉背，每處理噴1 mL，沉降30 s，95%乙醇做對(duì)照。將1 mL配制的萌發(fā)休止孢懸浮液噴于葉背，18℃培養(yǎng)箱16 h＋8 h光暗交替3～4 d調(diào)查。按發(fā)病面積占葉片面積的百分比分級(jí)，參照王文橋等[20]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，3次重復(fù)，計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防效。

根據(jù)盆栽幼苗法[21]測(cè)定稀釋液對(duì)晚疫病的防治效果。5種南藥植物粗提物及九里香粗提物分離組分設(shè)置質(zhì)量濃度為50 mg/mL，每株番茄分別用喉頭噴霧器均勻噴霧對(duì)應(yīng)稀釋液10 mL，95%乙醇做對(duì)照，24 h后每株噴霧接種致病疫霉孢子囊懸浮液（濃度1×105孢子囊/mL）10 mL，18℃培養(yǎng)室中16 h＋8 h光暗交替培養(yǎng)3～4 d調(diào)查，4次重復(fù)，計(jì)算病情指數(shù)和防效。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 20.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種南藥植物葉片乙醇粗提物對(duì)致病疫霉的抑菌活性

由表1可知，5種南藥植物粗提物對(duì)致病疫霉均有一定抑菌活性，其中九里香粗提物抑菌活性最高，對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)、休止孢萌發(fā)和休止孢侵染離體葉片的EC50值分別為6.51 mg/mL、3.77 mg/mL和19.56 mg/mL，顯著高于陰香粗提物對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)、休止孢萌發(fā)和休止孢侵染離體葉片的EC50值17.37 mg/mL、8.59 mg/mL和41.76 mg/mL；陰香粗提物對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)、休止孢萌發(fā)和休止孢侵染離體葉片的抑制作用又顯著高于黃皮、檳榔和胡椒粗提物。九里香粗提物對(duì)致病疫霉休止孢萌發(fā)的EC50值為3.77 mg/mL，顯著低于對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的EC50值6.51 mg/mL和對(duì)致病疫霉菌休止孢侵染離體葉片的EC50值19.56 mg/mL，可見九里香粗提物抑制致病疫霉休止孢萌發(fā)最有效。

表1 5 種南藥植物粗提物對(duì)致病疫霉離體及活體抑制作用

2.2 5種南藥植物粗提物對(duì)晚疫病的防治效果

由表2可知，5種南藥植物粗提物對(duì)晚疫病均有一定的防效。其中九里香粗提物防效最高，可達(dá)91.61%，顯著高于陰香粗提物的防效（80.73%），陰香粗提物的防效又分別顯著高于黃皮粗提物的防效（68.01%）、檳榔粗提物的防效（46.07%）及胡椒粗提物的防效（19.93%）。

表2 5 種南藥植物粗提物對(duì)晚疫病的防效

2.3 九里香粗提物各萃取組分對(duì)致病疫霉的抑制作用

由表3可知，九里香粗提物各萃取組分中石油醚和氯仿萃取組分對(duì)致病疫霉的抑制作用顯著高于乙酸乙酯萃取組分、正丁醇萃取組分和水相的抑制作用。石油醚萃取組分對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)EC50值為2.87 mg/mL，對(duì)致病疫霉休止孢萌發(fā)EC50值為1.85 mg/mL，對(duì)致病疫霉休止孢侵染離體葉片的EC50值為8.67 mg/mL；氯仿和石油醚萃取組分對(duì)休止孢萌發(fā)的抑制作用差異不顯著。

表3 九里香粗提物不同萃取組分對(duì)致病疫霉離體及活體抑制作用

2.4 九里香粗提物不同極性溶劑萃取組分對(duì)晚疫病的防效

由表4可知，九里香粗提物不同極性溶劑萃取組分對(duì)晚疫病均有一定的防效。石油醚和氯仿萃取組分防效較高，其中石油醚萃取組分防效為100%。經(jīng)比較，分離后的石油醚萃取組分對(duì)晚疫病的防效顯著高于分離前九里香粗提物的防效。

表4 九里香粗提物不同極性溶劑萃取組分對(duì)晚疫病的防效

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，5種南藥植物粗提物對(duì)致病疫霉均有一定的抑菌活性，其中九里香粗提物抑菌活性最高；九里香粗提物各萃取組分中，石油醚萃取組分對(duì)致病疫霉抑菌活性較高；5種南藥植物粗提物和九里香粗提物分離組分對(duì)致病疫霉休止孢萌發(fā)抑制作用強(qiáng)于對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)休止孢侵染離體葉片的活性；5種南藥植物葉片乙醇提取物和九里香粗提物不同極性溶劑萃取的分離組分對(duì)晚疫病均有一定防效，其中九里香粗提物和九里香粗提物石油醚萃取組分防治效果較好，與粗提物和分離組分對(duì)致病疫霉的抑菌活性結(jié)果一致，因此九里香粗提物和九里香粗提物石油醚萃取組分展示出一定的應(yīng)用前景。

篩選到植物粗提物和初分離組分具有較好的抑菌活性后，需分離并明確抑菌活性物質(zhì)的化學(xué)成分。盧遠(yuǎn)倩等[22]對(duì)九里香精油的組分進(jìn)行了分離，鑒定出主要抑菌活性物質(zhì)為n-棕櫚酸等；駱焱平等[23]對(duì)九里香層析物進(jìn)行分離得到7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素對(duì)香蕉炭疽等病原菌有較好抑菌活性。本研究有待進(jìn)一步采用薄層層析、柱層析、氣相色譜、液相色譜等方法分離活性成分，研究活性成分對(duì)致病疫霉的抑菌效果，并明確抗菌譜和作用機(jī)制，為將其作為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行仿生合成或結(jié)構(gòu)改造，開發(fā)新型殺菌劑提供依據(jù)。