基于QuEChERS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲殘留量的不確定度評定

武 源，覃慧麗

除蟲脲又名敵滅靈，是一種苯甲酰胺類殺蟲劑，具有對人畜低毒、對環(huán)境無公害等特點(diǎn)，其已被廣泛用于茶園害蟲的防治[1-5]。茶葉產(chǎn)業(yè)關(guān)乎我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展，茶葉質(zhì)量安全影響我國茶葉對外貿(mào)易，近年來，農(nóng)藥殘留已成為影響茶葉質(zhì)量安全的重要因素之一，除蟲脲及其降解產(chǎn)物殘留問題日益突出[6-8]，嚴(yán)重影響到茶葉質(zhì)量安全。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定茶葉中除蟲脲的最大殘留限量為20 mg/kg，日本和歐盟等進(jìn)口國家或地區(qū)均對茶葉制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量[9-10]，日本規(guī)定除蟲脲在茶葉中最大殘留限量為20 mg/kg[11]。由于茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的生物堿、色素、咖啡因、茶多酚等干擾物質(zhì)，使得農(nóng)殘檢測難度增大。為確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，對檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評定是必要的，不確定度評定對于檢測過程的質(zhì)量把控具有重要意義[12]。

目前除蟲脲在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法的不確定度判定研究基本空缺。本研究依據(jù)文獻(xiàn)[3-16]，對測定茶葉中除蟲脲殘留量進(jìn)行了分析與評定，明確了QuEChERS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲殘留量不確定的主要影響因素，為評價(jià)除蟲脲殘留量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

提取試劑：4 g MgSO4，1 g NaCl，0.5 g三水合二檸檬酸二鈉，1 g檸檬酸鈉及兩顆陶瓷均質(zhì)子，美國Agilent公司；凈化試劑管：1 200 mg MgSO4，400 mg PSA，400 mg C18，200 mg GCB，美國Agilent公司。

除蟲脲對照品（純度99.65%），德國Dr. Ehrenstorfe公司；三苯基磷酸酯對照品（TPP，純度99.6%），德國Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇、乙腈（均為色譜純），德國Merck公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純），德國Fluka公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ-S 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀、ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱（2.1×50 mm，1.7 μm），美國WATERS公司；XP26微量電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；IKA VORTEX 4 basic渦旋振蕩器，德國IKA公司；TTL-DC Ⅱ型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；SIGMA 3-3OK離心機(jī)，德國SIGMA公司；Milli-Q超純水設(shè)備，美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

陰性基質(zhì)溶液：稱取不含目標(biāo)物的茶葉按前處理步驟處理即得。

除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 μg/mL）：精確稱取5 mg除蟲脲對照品于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻線。

TPP內(nèi)標(biāo)儲備液（500 μg/mL）：精確稱取5 mg內(nèi)標(biāo)物對照品TPP于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻線。

除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)工作液（500 ng/mL）：精確吸取0.02 mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻線。

TPP內(nèi)標(biāo)工作液（5 μg/mL）：精確吸取0.2 mL的內(nèi)標(biāo)儲備液于20 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻線。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液槍分別精確移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL的氮吹管中，加入0.01 mL內(nèi)標(biāo)工作液，氮吹近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL陰性基質(zhì)溶液，渦旋復(fù)溶，即得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP質(zhì)量濃度的比值（C除蟲脲/CTPP）為橫坐標(biāo)，以除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP定量離子峰面積的比值（A除蟲脲/ATPP）為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 提取

茶葉粉碎后進(jìn)一步充分混勻，準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）茶葉置于50 mL具塞離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。離心管中加入0.10 mL TPP內(nèi)標(biāo)工作液，10 mL乙腈，加蓋渦旋振蕩30 s后加入提取試劑，立即劇烈振蕩1 min，防止結(jié)塊。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.3 凈化

取8 mL乙腈提取液轉(zhuǎn)移至15 mL凈化試劑管中，蓋緊離心管，充分渦旋振蕩1 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心5 min，凈化液過0.22 μm濾膜后，取1 mL氮吹近干，加入1 mL水-甲醇（9∶1，V/V）渦旋混勻后上機(jī)分析。

1.3.4 LC-MS/MS條件1.

3.4.1 液相條件

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）采集模式，正離子掃描。目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、定量離子對和定性離子對見表1。

表1 化合物保留時(shí)間及離子對

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

茶葉中目標(biāo)物殘留量X按公式（1）計(jì)算：

式中：X為茶葉中除蟲脲的殘留量，mg/kg；C0為從基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的茶葉溶液中除蟲脲的質(zhì)量濃度，ng/mL；V為茶葉經(jīng)前處理后的稀釋體積，mL；m為稱取茶葉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr（2.1）

2.1.1 除蟲脲純度產(chǎn)生的不確定度μr(P)

除蟲脲的純度為99.65%，查閱除蟲脲對照品標(biāo)準(zhǔn)證書，其不確定度U95為0.30%，在95%置信水平下，k=2，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(P)=0.15%，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(P)=0.001 5。

2.1.2 除蟲脲稱量產(chǎn)生的不確定度μr(M)

精密稱量除蟲脲對照品5.757 mg，用乙腈稀釋并定容至10 mL，得到除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液。微量電子分析天平校準(zhǔn)不確定度為主要分量，根據(jù)分析天平檢定證書，本試驗(yàn)所用天平的最大允許誤差為0.005 mg，按照均勻分布計(jì)算則除蟲脲標(biāo)不確定度μr(M)=0.002 9 mg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(M)=0.000 5。

2.1.3 配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(V)

根據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器》[17]檢定規(guī)程的A級最大允許誤差（以下玻璃量器均按A級進(jìn)行評定）及廣西壯族自治區(qū)計(jì)量檢測研究院提供的實(shí)驗(yàn)室移液槍的檢定證書，按照式（2）計(jì)算量器容量允差產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(V校準(zhǔn))：

式中：a校準(zhǔn)為玻璃器具校準(zhǔn)引起的體積偏差；k取平均分布，即

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度波動(dòng)范圍為（20±5）℃，20℃乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，根據(jù)式（3）計(jì)算室溫波動(dòng)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(V溫度)：

式中：a溫度為實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度波動(dòng)帶來的溶劑體積偏差；k取平均分布，即

分別移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL的氮吹管中，加入0.01 mL內(nèi)標(biāo)工作液，氮吹近干，用移液槍準(zhǔn)確加入1 mL陰性基質(zhì)溶液，充分渦旋。實(shí)驗(yàn)中配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)移取和定容步驟，用到不同規(guī)格的移液槍和容量瓶，均按平均分布計(jì)算各分量合成配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(V)（表2）。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋過程由上述19次移液，2次定容完成，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(V)=0.021。

表2 量器引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由此，稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr（2.1）：

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度μr（2.2）

配制除蟲脲6個(gè)質(zhì)量濃度分別為5.734、11.47、28.67、57.34、114.7、286.7 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重復(fù)測定3次。由于實(shí)驗(yàn)全程加入同一瓶內(nèi)標(biāo)使用液，內(nèi)標(biāo)濃度一致，無需考慮內(nèi)標(biāo)使用液濃度引入的不確定度，只需考慮內(nèi)標(biāo)使用體積引入的不確定度，為方便計(jì)算實(shí)驗(yàn)將內(nèi)標(biāo)TPP質(zhì)量濃度設(shè)為1 ng/mL。即除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP質(zhì)量濃度比值x分別為5.734、11.47、28.67、57.34、114.7、286.7，得到除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP定量離子豐度比值y，以x為線性橫坐標(biāo)，y為線性縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)線性方程y=kx＋b及相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果詳見表3。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

式中：n為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液測定的點(diǎn)數(shù)，n=6；p為樣品平行測定的個(gè)數(shù)，p=6；yi為各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度對應(yīng)的響應(yīng)比值（Ai目標(biāo)物/Ai內(nèi)標(biāo)）；x0為樣品測得濃度均值，以回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線校正所得含量均值計(jì)，為97.70 ng/mL（表4）；xˉ為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值，為84.10 ng/mL（表3）；b為直線截距，為0.007 3。

表3 基質(zhì)標(biāo)曲擬合數(shù)據(jù)

注：把xi代入直線方程得理論y值，把yi代入直線方程得理論x值。

因此，基質(zhì)標(biāo)曲擬合的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(2.2)=0.012。

2.3 茶葉試樣前處理產(chǎn)生的不確定度μr（2.3）

試樣稱量、稀釋時(shí)產(chǎn)生的不確定度是未知試樣前處理過程常見的不確定度。實(shí)驗(yàn)全程加入同一瓶內(nèi)標(biāo)使用液，內(nèi)標(biāo)濃度一致，由于考慮了內(nèi)標(biāo)使用體積產(chǎn)生的不確定度，即試樣稀釋體積不影響到定量結(jié)果，實(shí)驗(yàn)無需再考慮試樣前處理稀釋體積引起的不確定度。

2.3.1 茶葉試樣稱量產(chǎn)生的不確定度μr(m)

檢定天平檢定證書，其最大允許誤差為0.5 mg，已知稱樣2 g，取矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ(m)=0.289 mg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μr(m)=0.000 1。

2.3.2 茶葉試樣加入內(nèi)標(biāo)體積產(chǎn)生的不確定μr(v)

前處理過程在茶葉試樣中加入0.1 mL內(nèi)標(biāo)TPP使用液，根據(jù)移液槍檢定證書容量允差及溫度波動(dòng)引起的體積變化（表2），相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(v)=0.009。

由此，未知試樣前處理時(shí)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(2.3)：

2.4 茶葉試樣測定重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度μr（2.4）

準(zhǔn)確稱取6份茶葉試樣，經(jīng)提取、凈化步驟，進(jìn)樣分析。試樣平行測量結(jié)果見表4。

表4 試樣測定重復(fù)性結(jié)果

試樣測定均值Sˉ=0.479 mg/kg（n=6），標(biāo)準(zhǔn)偏差S樣品=0.006 2 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)不確定度mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5 茶葉試樣加標(biāo)回收產(chǎn)生的不確定度μr（2.5）

稱取陰性基質(zhì)隨行加標(biāo)，考察回收率產(chǎn)生的不確定度。陰性基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6次測定（n=6），除蟲脲加標(biāo)量為114.7 ng，回收率計(jì)算結(jié)果見表5。

表5 茶葉中除蟲脲加標(biāo)回收率結(jié)果

加收率均值Sˉ=95.2%（n=6），回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差S回收=1.4%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

使用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)平均回收率與回收率期望值100%的差異：

查表得，t0.95（5）=2.57＜8.00，顯示回收率結(jié)果與100%有顯著性差異，表明樣品測定需要用回收率進(jìn)行結(jié)果校正，校正后的結(jié)果為0.503 mg/kg。

2.6 不確定度的合成

除蟲脲各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表6，則除蟲脲的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表6 茶葉中除蟲脲各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度統(tǒng)計(jì)

折算成除蟲脲合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果

在P=95%置信水平，測量結(jié)果擴(kuò)展不確定度取擴(kuò)展因子k=2，則茶葉中除蟲脲殘留量測定的擴(kuò)展不確定度為：U(C)=kμ(C)=0.028 mg/kg。因此，茶葉試樣中除蟲脲的殘留量表示為（0.503±0.028）mg/kg（k=2）。

3 結(jié)論與討論

通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲殘留量的不確定度，得出該測定方法的擴(kuò)展不確定度為0.028 mg/kg。從表6可見，稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(2.1)分量對合成不確定度的貢獻(xiàn)最大，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度μr(2.2)次之。其中，在合成μr(2.1)眾多的小分量中，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入的不確定度μr(V)，影響最為顯著。因此，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)使用允差范圍小的移液槍，保持恒溫恒濕的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，注意操作人員的熟練水平，把控好內(nèi)標(biāo)加入體積的重復(fù)性，皆有助于減小配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。此外，盡可能提高曲線擬合的線性，例如標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)點(diǎn)測量多次，測量值取平均值進(jìn)行擬合，線性范圍內(nèi)多取幾個(gè)濃度點(diǎn)，并確保樣品測定結(jié)果在曲線范圍的中高段等，可降低測定結(jié)果的不確定度。