優(yōu)質(zhì)早秈不育系HD9802S不育基因tms5的遺傳分析及應(yīng)用研究

張晴雯，馬瑞景，張海濤，袁文雅

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

HD9802S是湖北大學(xué)水稻育種團隊培育的優(yōu)質(zhì)早秈不育系，具有不育性穩(wěn)定、品質(zhì)優(yōu)、株葉型態(tài)好、早熟等優(yōu)點[1]. 利用HD9802S不育系，湖北大學(xué)已培育出兩優(yōu)287(HD9802S/R287)、兩優(yōu)42(HD9802S/R42)等多個優(yōu)質(zhì)早秈水稻品種，獲得湖北省技術(shù)發(fā)明一等獎一項(水稻溫敏核不育系HD9802S的選育與應(yīng)用，2015)、湖北省科技進(jìn)步一等獎兩項(國優(yōu)高產(chǎn)雜交早稻兩優(yōu)42的選育與應(yīng)用，2014；國標(biāo)一級超級雜交早稻兩優(yōu)287的選育與應(yīng)用，2008)、湖北省科技成果推廣二等獎一項(國標(biāo)一級超級雜交早稻兩優(yōu)287的選育與應(yīng)用，2011). 雖然HD9802S不育系已廣泛應(yīng)用，但其相關(guān)的不育基因的克隆及作用機理還不清楚.

HD9802S是溫敏不育系，用于兩系法雜交育種，目前兩系雜交稻的不育系主要是細(xì)胞核雄性不育系，且其不育的特性在一定的光溫條件下可發(fā)生改變，變成可育. 光溫敏不育基因根據(jù)受不同光溫的影響命名為光敏(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)基因或溫敏(thermo-sensitive genic male sterile, TGMS)基因. 2012年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)相繼報道了對光敏雄性不育基因pms3的成功克隆和功能分析[2-3]，其中華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)團隊從農(nóng)墾58S中克隆的pms3編碼一個1 236 bp的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)，農(nóng)墾58中堿基G突變成農(nóng)墾58S中的堿基C，該單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)引起lncRNA二級結(jié)構(gòu)的改變，造成其啟動子區(qū)域DNA中CG甲基化程度的升高，并抑制了基因在長日照下幼穗中的表達(dá)量，導(dǎo)致雄性不育[2]；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光團隊從來源于農(nóng)墾58S的衍生系培矮64S中克隆到光溫敏基因p/tms12-1，其與pms3產(chǎn)生相同的SNP，屬于同一個基因，研究表明該SNP位于一個21 nt的小RNA osa-smR5864m的第11位上，而osa-smR5864m本身在培矮64S并沒有被抑制表達(dá)，推測osa-smR5864w可能是通過抑制下游靶基因的表達(dá)，最終造成光溫敏不育[3]. 2016年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)團隊又從農(nóng)墾58S中克隆了光敏基因pms1[4]，研究顯示pms1基因是一個不完全顯性基因，也是編碼1個長鏈非編碼RNA，該基因的轉(zhuǎn)錄本PMS1T能被micro-RNA2118識別并介導(dǎo)剪接，之后從剪接位點開始形成一串21 nt且為植物特有的非編碼RNA最新成員phasiRNA (phased small-interfering RNAs). 農(nóng)墾58S與可育品種在pms1區(qū)間剪接位點下游的24 bp處有1個堿基的突變，這一突變導(dǎo)致農(nóng)墾58S在長日照下能夠產(chǎn)生更多的phasiRNA， 從而造成雄性不育[4]. 除了上述光敏基因的克隆，2014年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)莊楚雄團隊從安農(nóng)S-1中成功克隆了溫敏基因tms5[5]. 研究顯示TMS5編碼一個RNA酶Z (RNase Zs1)，不育系中單堿基突變(第71位C突變成A)造成RNase Zs1蛋白質(zhì)翻譯提前終止，進(jìn)一步研究表明RNase Zs1蛋白本身不受溫度影響，但其下游作用底物UbL40(泛素核糖體L40蛋白)受高溫誘導(dǎo)高表達(dá)，不育系中RNase Zs1蛋白功能缺失，不能有效降解UbL40的mRNA，使其在高溫下過度積累，導(dǎo)致高溫不育[5].

Zhou H等[5]通過測序確定HD9802S中tms5基因位點存在同樣位置同樣方向的單堿基突變(第71位C突變成A)，至此我們推測不育系HD9802S中的TGMS性狀即是tms5突變造成的. 為進(jìn)一步驗證這一推論，我們首先通過測序再次確認(rèn)HD9802S中存在相同的SNP，其次通過互補實驗證明HD9802S不育系在高溫下不育的特性可以被野生型TMS5恢復(fù). 同時我們通過基因編輯技術(shù)將R287中的野生型TMS5敲除，在高溫下R287由可育變成不育，這些遺傳實驗證據(jù)表明tms5即是控制HD9802S在高溫下不育的基因，且通過選擇合適的受體材料，利用基因編輯技術(shù)敲除TMS5基因，可以創(chuàng)建新的優(yōu)質(zhì)不育系.

1 材料與方法

1.1 實驗材料轉(zhuǎn)基因受體材料HD9802S及R287，由湖北大學(xué)水稻育種團隊提供；轉(zhuǎn)化骨架載體pCAMBIA1300及pYLCRISPR/Cas9-MH，由武漢天問生物科技有限公司提供.

1.2 實驗方法

1.2.1 HD9802S及R287中TMS5基因位點的序列分析 以日本晴(Nipponbare)參考基因組為模板，設(shè)計引物，擴增出HD9802S及R287中TMS5基因座位的序列，進(jìn)行blast比較分析，確定HD9802S及R287中TMS5基因序列.

1.2.2 互補載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 以R287基因組為模板，PCR擴增出整個TMS5基因序列(gTMS5-F + gTMS5-R)，通過酶切重組方法將野生型TMS5基因構(gòu)建到互補載體pCAMBIA1300上，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將野生型TMS5基因轉(zhuǎn)入受體材料HD9802S，載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化由武漢天問生物科技有限公司完成. 本實驗中涉及的主要引物序列見表1.

1.2.3 基因編輯載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 參考R287中TMS5基因座位的序列，在第一個外顯子中設(shè)計2個CRISPR/Cas9基因編輯的靶點，同時構(gòu)建到基因編輯載體pYLCRISPR/Cas9-MH上，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建完成的基因編輯載體轉(zhuǎn)入受體材料R287，載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化由武漢天問生物科技有限公司完成.

表1 本實驗所用主要引物情況

1.2.4 轉(zhuǎn)基因遺傳材料的鑒定及分析 針對互補實驗的轉(zhuǎn)基因植株T0代收種﹑T1代共分離檢測及育性表型觀察，共分離檢測主要是通過PCR檢測T1代分離群體中轉(zhuǎn)基因單株為陽性的基因型是否與可育的表型完全對應(yīng)起來；針對基因編輯的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行T0代轉(zhuǎn)基因單株的基因編輯結(jié)果檢測及育性表型觀察，基因編輯結(jié)果分析主要是通過PCR擴增出編輯靶點位置及附近兩端部分序列，進(jìn)行TA克隆，再測序，比較分析具體的基因編輯結(jié)果及可能造成的蛋白編碼氨基酸的改變，再結(jié)合T0代轉(zhuǎn)基因單株的育性表型，進(jìn)一步確定基因型與育性表型的對應(yīng)關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 HD9802S中tms5基因編碼區(qū)存在點突變并導(dǎo)致提前終止，R287中TMS5基因位點編碼區(qū)完全正常2014年Zhou H等[5]從安農(nóng)S-1中克隆到控制TGMS的TMS5基因，文中對HD9802S也進(jìn)行測序，結(jié)果表明HD9802S中TMS5基因位點存在單堿基突變，為進(jìn)一步確定HD9802S及R287中TMS5基因位點的序列，我們以日本晴基因組序列為模板，設(shè)計引物，PCR擴增出HD9802S及R287中TMS5基因座位的序列并測序，拼接出各自完整的TMS5基因座位的序列，blast比較分析結(jié)果顯示HD9802S中tms5基因編碼區(qū)序列與安農(nóng)S-1及株1S相同(圖1A及圖1B)，都是在基因編碼區(qū)第24位氨基酸處突變成終止密碼子(TCG突變成TAG)，而R287中TMS5位點的編碼區(qū)與粳稻參考基因組日本晴及秈稻參考基因組93-11完全相同(圖1A及圖1C).

圖1 不同水稻品種TMS5基因位點部分編碼區(qū)序列圖1A展示日本晴﹑93-11﹑安農(nóng)﹑安農(nóng)S-1﹑株1S﹑HD9802S及R287等 不同水稻品種TMS5基因位點部分編碼區(qū)序列.圖1B及圖1C分別表示 HD9802S及R287的TMS5基因部分位點的測序序列，紅色線段是突變產(chǎn)生位點

2.2 R287中TMS5基因可恢復(fù)HD9802S在高溫條件下的育性不育系HD9802S在武漢種植時，若在7月之前種植，在生殖轉(zhuǎn)換期是高溫(≥28 ℃)，不育[1]；若是在7月中旬之后種植，在生殖轉(zhuǎn)換期是低溫(≤23 ℃)，可育. 為進(jìn)一步驗證不育系HD9802S高溫不育﹑低溫可育的特性是由tms5基因控制，我們將來源于R287的野生型TMS5基因轉(zhuǎn)入HD9802S中，轉(zhuǎn)入的TMS5基因結(jié)構(gòu)如圖2A所示，外源片段包括2 006 bp的啟動子區(qū)域、1 896 bp的基因組上編碼區(qū)及終止密碼子后883 bp，總長4 885 bp，擴增引物為gTMS5-F及gTMS5-R. 互補實驗中T-DNA上基因結(jié)構(gòu)圖如圖2B所示.

圖2 TMS5基因結(jié)構(gòu)圖及相關(guān)轉(zhuǎn)化載體圖圖2A是互補實驗中來源于R287的TMS5基因結(jié)構(gòu)圖.圖2B是互補載體中T-DNA上基因結(jié)構(gòu)圖.圖2C是基因編輯 載體中T-DNA上基因結(jié)構(gòu)圖.圖2D是R287中TMS5基因第一個外顯子內(nèi)2個打靶位點的部分序列圖. 基因組中 起始密碼子ATG的第一個A作為+1，LB、RB分別是T-DNA左右邊界序列，Hyg：潮霉素篩選基因，gTMS5：R287的 TMS5基因，mpCas9：基因編輯Cas9基因，Target 1：基因打靶靶點1，Target 2：基因打靶靶點2，PAM:原間隔基序， U6a-gRNA (Target 1): 靶點1的U6a啟動子驅(qū)動的RNA表達(dá)盒，U6b-gRNA(Target 2): 靶點2的U6b啟動子驅(qū)動的RNA表達(dá)盒

2018年底我們從公司獲得獨立陽性轉(zhuǎn)基因單株7株(圖3A)，之后送海南収種，獲得6個單株的T1代種子. 2019年5月在武漢種植這6個T1代家系，同時種植2行20株HD9802S作對照，10月觀察表型. 結(jié)果顯示20株HD9802S幾乎完全不育(個別單株有1～2粒種子)，而6個T1代轉(zhuǎn)基因家系中除第6個家系(15棵)全部可育，育性表型沒有分離外(原因可能是轉(zhuǎn)基因多拷貝)，剩余5個T1代家系的育性表型均發(fā)生分離(即有些單株完全不育，有些單株可育)，具體統(tǒng)計結(jié)果見表2.

表2 互補實驗T1代表型及共分離結(jié)果

為從遺傳上進(jìn)一步證明TMS5基因控制HD9802S育性，我們對互補實驗中T1代家系每個單株都抽提DNA，進(jìn)行PCR陽性檢測，檢測膠圖如下(圖3B～3G).

PCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因陽性單株均是可育的單株，轉(zhuǎn)基因陰性單株均是完全不育的單株，T1代分離群體所有單株的基因型與表型完全對應(yīng)，共分離實驗證明HD9802S由不育變可育的特性是由TMS5基因控制的.

圖3 互補轉(zhuǎn)基因單株T0代陽性檢測及T1代共分離檢測圖3A是互補實驗轉(zhuǎn)基因單株(7株)T0代陽性檢測.圖3B～3G分別為6個T1代家系的陽性檢測(依次分別為 gTMS5-HD9802S-#1至gTMS5-HD9802S-#6). M: DNA標(biāo)記(DL2000)，NC: 陰性對照， PC: 陽性對照，PCR檢測引物為Hyg-F及Hyg-R，產(chǎn)物大小為594 bp

2.3 敲除R287中TMS5基因可使R287由可育變成不育為更進(jìn)一步從遺傳上證明TMS5基因控制育性，同時驗證創(chuàng)建新的不育系的可能，我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除R287中TMS5基因.針對TMS5基因序列，我們在基因的第一個外顯子內(nèi)設(shè)計2個基因打靶靶點(Target 1: GAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG; Target 2: GCTCGGACTGGTCCATGGAGCGG)，將2個靶點的表達(dá)盒同時構(gòu)建到轉(zhuǎn)化載體pYLCRISPR/Cas9-MH上，轉(zhuǎn)化R287. 用于構(gòu)建載體的相關(guān)引物見表1，構(gòu)建完成的基因編輯載體T-DNA上基因結(jié)構(gòu)圖如圖2C，打靶位點的堿基順序見圖2D. 2019年4月我們從公司獲得獨立陽性轉(zhuǎn)基因單株5株，并于2019年6月在武漢種植，同期種植2行20株R287作對照，10月觀察表型，結(jié)果顯示20株R287完全可育，而5株T0代轉(zhuǎn)基因單株都完全不育. 針對這5株轉(zhuǎn)基因單株，我們首先在2個編輯靶點兩端設(shè)計引物gTMS5-F1及gTMS5-R1(表1)，PCR擴增并測序，結(jié)果顯示除第2號單株測序序列可讀，剩余4個單株在靶點位置開始出現(xiàn)雙峰，說明在靶點位點有編輯發(fā)生. 為進(jìn)一步確定每個單株具體的編輯情況，對4個測序出現(xiàn)雙峰的單株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，再隨機挑4個單克隆測序，測序結(jié)果顯示5個單株都有不同情況的編輯，具體每個單株的編輯情況見圖4，編輯后造成的影響見表3. 從編輯結(jié)果分析，5個T0代轉(zhuǎn)基因單株都造成TMS5編碼蛋白的改變，很可能造成蛋白功能失活；從表型上看，5個單株的確都不育，由此我們確定TMS5功能失活可使R287由可育變不育.

圖4 基因編輯轉(zhuǎn)基因陽性單株(5株)，編輯單株測序圖片圖4A顯示R287來源的TMS5基因的打靶位點序列圖；圖4B～4F分別是5個轉(zhuǎn)基因T0代單株(依次是 critms5-#1～critms5-#5)的具體編輯結(jié)果；圖4G是critms5-#5單株的編輯靶點附近的測序圖

表3 基因編輯T0代單株編輯結(jié)果總結(jié)

3 討論

3.1 不育系HD9802S的不育基因即是tms5基因，可能來源于安農(nóng)S-1測序結(jié)果表明HD9802S中tms5基因位點存在點突變導(dǎo)致編碼蛋白RNase Zs1翻譯提前終止，蛋白功能喪失，最終造成溫敏不育的表型. 將野生型TMS5基因?qū)際D9802S后，可使HD9802S由不育變可育；同時在正?？捎贩NR287中敲除TMS5基因，可使R287 由可育變不育，以上實驗從遺傳學(xué)上證明了HD9802S的不育基因即是tms5基因. 從單個基因序列結(jié)果來看，HD9802S的tms5基因編碼序列與安農(nóng)S-1的tms5基因編碼序列完全相同，二者存在完全相同位點相同方向的點突變，由于安農(nóng)S-1最早是在1987年發(fā)現(xiàn)，之后被育種家們廣泛應(yīng)用于兩系雜交育種[6-7]，而HD9802S最早由湖北大學(xué)育種團隊在1998年獲得，雖然HD9802S的選育從系譜記載上看與安農(nóng)S-1沒有關(guān)系[8]，但由于發(fā)現(xiàn)較晚，因此我們推測HD9802S的tms5基因很可能來源于安農(nóng)S-1(原因可能是基因漂移).

3.2 選擇合適的受體材料，通過基因編輯技術(shù)敲除其TMS5基因可以創(chuàng)建新的優(yōu)質(zhì)不育系安農(nóng)S-1的高溫不育﹑低溫可育的特性由功能缺失tms5基因控制，通過基因編輯技術(shù)敲除TMS5可使受體材料具有TGMS特性. 目前全國多家單位已開展利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除特定品種的TMS5基因創(chuàng)建新的不育系的工作[9-10], 各地方單位可以選擇本地合適的育種親本，針對除育性外其它方面都適合作為不育系的親本材料，測序驗證具有野生型的TMS5基因后，通過基因編輯技術(shù)敲除其TMS5基因，創(chuàng)建新的優(yōu)質(zhì)不育系用于本地的兩系法雜交育種.