評(píng)估霉菌毒素脫毒產(chǎn)品的體外方法

劉云福

摘? 要：霉菌毒素污染飼料是一個(gè)世界性的安全問題，給全球各地的經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。本文簡(jiǎn)要介紹了減少霉菌毒素污染的可行性產(chǎn)品以及體內(nèi)和體外檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：霉菌毒素;吸附劑;生物轉(zhuǎn)化脫毒劑;胃腸道模型

霉菌毒素污染飼料是一個(gè)世界性的安全問題，給全球各地的經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。

霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的一類穩(wěn)定的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，一旦生成極難被清除。人或動(dòng)物采食被霉菌毒素污染的食物或日糧后健康會(huì)受到不良的影響，可出現(xiàn)畸形、癌癥、雌激素樣刺激或者免疫抑制。

用物理或化學(xué)方法處理霉菌毒素通常會(huì)影響飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這也是為什么生物學(xué)方法通常被認(rèn)為是減少動(dòng)物攝入霉菌毒素的最可靠方法。

1? 降低霉菌毒素污染的可行性

在飼料中添加脫毒劑的目的是降低霉菌毒素的生物利用率，從而減少動(dòng)物攝入的霉菌毒素?cái)?shù)量，防止霉菌毒素在血液及組織中大量擴(kuò)散。

脫毒劑通常可分為兩類：霉菌毒素吸附劑和生物轉(zhuǎn)化脫毒劑。

這些產(chǎn)品吸附和降解霉菌毒素的能力必須進(jìn)行測(cè)試。在進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)之前，體外分析是篩選和選擇脫毒劑的一個(gè)強(qiáng)有力的工具;體內(nèi)試驗(yàn)的成本昂貴，應(yīng)根據(jù)3R[研究所用動(dòng)物的替換（Replacement）、減少（Reduction）和精選（Refinement）]原則，盡可能減少體內(nèi)試驗(yàn)。

科研人員已經(jīng)成功開發(fā)出多種霉菌毒素檢測(cè)模型，從簡(jiǎn)單的濃度測(cè)定到更為精細(xì)的模擬動(dòng)物胃腸道的模型。本文的目的是調(diào)查現(xiàn)有的體外測(cè)試方法，以評(píng)估霉菌毒素解毒劑的功效，并確定最佳的預(yù)篩選策略。

2? 霉菌毒素脫毒劑

目前尚無可以評(píng)估霉菌毒素脫毒劑功效的國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在歐盟委員會(huì)發(fā)布的386/2009號(hào)委員會(huì)條例中，霉菌毒素脫毒劑在功能性飼料添加劑中被定義為“可減少霉菌毒素對(duì)飼料污染的物質(zhì)，該物質(zhì)可抑制或減少動(dòng)物對(duì)霉菌毒素的吸收，促進(jìn)霉菌毒素的排泄或改變其作用方式”。該法規(guī)所列出的飼料添加劑以化學(xué)分子式、種類和分析方法等方式進(jìn)行精確定義，并在數(shù)期歐盟公報(bào)的若干法律文本中進(jìn)行了詳細(xì)說明。

由于脫毒劑的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性，用于評(píng)估它們對(duì)霉菌毒素脫毒能力的作用機(jī)制和檢測(cè)方法要視脫毒劑類型的不同而有所區(qū)別。

2.1 霉菌毒素吸附劑

霉菌毒素吸附劑也叫霉菌毒素結(jié)合劑，是一類以硅酸鹽為主要成分的無機(jī)化合物，或者是一類碳基類有機(jī)聚合物。無機(jī)類吸附劑包括天然的黏土產(chǎn)品（水合鋁硅酸鈉鈣、沸石和膨潤(rùn)土）以及合成多聚體，有機(jī)類吸附劑包括一些酵母細(xì)胞壁成分、活性炭、合成多聚體、腐殖質(zhì)和日糧纖維。

吸附劑能夠在動(dòng)物的胃腸道中吸附霉菌毒素且不會(huì)解離。通過這種方式，霉菌毒素-吸附劑復(fù)合體能夠與糞便一起排出體外，因此可以減少動(dòng)物吸收的霉菌毒素?cái)?shù)量。

不同類型分子間的交互作用可能參與相同的吸附過程（疏水性、靜電吸附、分子識(shí)別）。

2.2 生物轉(zhuǎn)化脫毒劑

霉菌毒素生物轉(zhuǎn)化脫毒劑含有大量的微生物和能夠降解或中和多種霉菌毒素的純合酶，如細(xì)菌、酵母、真菌、原生動(dòng)物和酶。

在選擇脫毒劑和吸附劑時(shí)，必須同時(shí)觀察產(chǎn)品的定性和定量特性（如親和力、容量和選擇性等）。定量特性應(yīng)盡可能以能夠比較吸附劑并可預(yù)測(cè)不同條件下功效的方式來表述。

3? 試驗(yàn)性研究回顧

霉菌毒素的體外吸附預(yù)備試驗(yàn)被認(rèn)為是篩選有潛力的霉菌毒素脫毒劑的最佳方法。實(shí)際上，如果脫毒劑在體外試驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出吸附作用，那么它很難在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮吸附作用。

就霉菌毒素吸附劑而言，要測(cè)定其對(duì)霉菌毒素解毒的能力，需要進(jìn)行不同類型的試驗(yàn)。

3.1 “單一濃度”檢測(cè)法

“單一濃度”檢測(cè)法是體外試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的方法，加入特定濃度的脫毒劑后，可以測(cè)定固定濃度下水性介質(zhì)中對(duì)純的合成霉菌毒素的吸附作用。這種方法操作簡(jiǎn)單、成本低且不會(huì)浪費(fèi)脫毒劑，對(duì)具有類似作用機(jī)制的吸附劑進(jìn)行比較非常有效。然而，檢測(cè)結(jié)果取決于吸附劑的濃度，由于不是真實(shí)的胃腸道環(huán)境，很難將結(jié)果與動(dòng)物體內(nèi)真實(shí)的情況關(guān)聯(lián)起來。

3.2 “等溫線”檢測(cè)法

“等溫線”檢測(cè)法的目的是獲得一條能夠說明相對(duì)于介質(zhì)中最早的霉菌毒素濃度的單位重量吸附劑所吸附霉菌毒素量的曲線。該檢測(cè)通常能夠給出恒溫下某一濃度的吸附劑對(duì)不同濃度的純霉菌毒素的吸附曲線，也可以反推。

“等溫線”檢測(cè)法可以在水性介質(zhì)中進(jìn)行，也可以在存在或缺乏飼料基質(zhì)的情況下進(jìn)行。分析這些研究的結(jié)果常?？梢栽u(píng)估與霉菌毒素污染相關(guān)的基質(zhì)是否會(huì)影響吸附劑的功效。

由于吸附研究考慮了吸收過程（平衡）的可逆性，因此能讓我們更好地了解吸附劑的功效。這被認(rèn)為是可以測(cè)定霉菌毒素吸附劑總吸附能力的最佳分析方法之一。

相比“單一濃度”檢測(cè)法，這些方法操作更復(fù)雜，完成對(duì)照研究需要花費(fèi)更多的時(shí)間，而且成本更高。

3.3 靜態(tài)胃腸道模型和動(dòng)態(tài)胃腸道模型試驗(yàn)

靜態(tài)胃腸道模型和動(dòng)態(tài)胃腸道模型試驗(yàn)是使用胃腸道模型進(jìn)行的體外檢測(cè)法，這些模型盡量模擬豬胃腸道的生理?xiàng)l件，并考慮胃腸道中的消化酶及其濃度、pH、消化時(shí)間和鹽濃度等因素。

靜態(tài)胃腸道模型試驗(yàn)在每個(gè)消化階段使用固定濃度的酶、鹽和膽汁酸，動(dòng)態(tài)胃腸道模型試驗(yàn)可以模擬與蠕動(dòng)瓣膜相連的胃腸道（胃/瘤胃、十二指腸、結(jié)腸和回腸）的不同區(qū)段，并動(dòng)態(tài)加入?yún)⑴c消化過程的消化液，它可能包含或不包含自然污染的飼料。

動(dòng)態(tài)模型是能夠與動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)雜性相比的最合適方法，還可以研究霉菌毒素的生物可接受性。實(shí)際上，這一研究可以通過模擬或者建立腸道屏障模型（細(xì)胞培養(yǎng)）來完成。

這種方法能夠測(cè)定霉菌毒素通過動(dòng)物空腸上皮細(xì)胞（如豬小腸上皮細(xì)胞）的核纖層蛋白轉(zhuǎn)移，黏膜上皮單獨(dú)或與吸附劑一起接觸霉菌毒素。它也可以用于評(píng)估吸附劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和（或）治療性物質(zhì)的潛在干擾，還可以評(píng)估消化道上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性。

它為關(guān)于霉菌毒素代謝的經(jīng)典體外研究提供了補(bǔ)充信息，這是最關(guān)鍵的一步。然而，這些研究需要良好的細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)技術(shù)，并且成本昂貴。

霉菌毒素生物轉(zhuǎn)化脫毒劑對(duì)霉菌毒素的解毒性能通常利用“孵育研究”在體外進(jìn)行評(píng)估。

在適合微生物生長(zhǎng)的條件（溫度、攪動(dòng)作用、有氧或者厭氧和生理合適的pH）下，微生物（細(xì)菌、真菌和酵母）與霉菌毒素在緩沖液中或者在特定肉湯培養(yǎng)液中混合。

一些不同的肉湯培養(yǎng)液利用復(fù)雜的基質(zhì)（如瘤胃液、消化糜或含飼料的基質(zhì)）進(jìn)行了測(cè)試。對(duì)酶而言，孵育研究通常以同樣的方法在緩沖液中進(jìn)行，孵育時(shí)間從幾分鐘到幾天不等。

要產(chǎn)生適合酶活性的最佳條件，溫度和pH可能也不同。需要考慮的重要因素是被測(cè)脫毒劑能降解霉菌毒素而不會(huì)產(chǎn)生具有潛在毒性作用的代謝物。

實(shí)際上，不一定每一種反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生真正的解毒作用，因?yàn)榇x產(chǎn)生的產(chǎn)物可能具有比其母本化合物更大的毒性。例如，酵母在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的生物轉(zhuǎn)化就屬于這種情況，它能夠?qū)EN還原為α-玉米赤霉烯醇，后者會(huì)產(chǎn)生比ZEN更強(qiáng)的雌激素樣刺激。

4? 定量方面

無論被測(cè)試的脫毒劑和所用的研究條件如何，都需要使用霉菌毒素定量系統(tǒng)。最常用的方法是液相色譜法（Liquid Chromatograpy，LC）或者氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）以及免疫化學(xué)法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。

分析工具的類型和樣品準(zhǔn)備（提取和純化）所用的方法高度依賴于所測(cè)定的霉菌毒素的結(jié)構(gòu)。

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一種測(cè)定霉菌毒素的法定方法。此方法可與紫外分光檢測(cè)、熒光檢測(cè)、安培檢測(cè)或熒光分光光度檢測(cè)結(jié)合使用，正相HPLC和反相HPLC均可用于霉菌毒素的分離和純化。多種霉菌毒素有自然的熒光（如棕曲霉毒素），因此可以直接用HPLC-熒光法（HPLC-fluorescence，HPLC-FD）檢測(cè)。其他霉菌毒素，如伏馬菌素，可能需要上游定量步驟，如衍生作用，可以使用鄰苯二甲醛或9-（芴基甲基）氯甲酸酯進(jìn)行。

氣相色譜法是一種適用于檢測(cè)揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性化合物的技術(shù)。通過將該系統(tǒng)鏈接到質(zhì)譜儀（Mass-Spectrometry，MS）、氫火焰離子化檢測(cè)器或傅立葉變換紅外光譜儀來完成檢測(cè)。大多數(shù)霉菌毒素不具有揮發(fā)性，因此需要上游定量步驟。

層析色譜法被認(rèn)為是檢測(cè)霉菌毒素最精確且最可靠的方法。然而，當(dāng)體外試驗(yàn)要檢測(cè)多個(gè)參數(shù)且分析次數(shù)很多時(shí)，昂貴的設(shè)備、必須由熟練的檢測(cè)人員操作以及分析所需的時(shí)間長(zhǎng)可能是限制此方法應(yīng)用的因素。

對(duì)檢測(cè)精確、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低和速度快的要求促使科研人員開發(fā)霉菌毒素定量檢測(cè)的免疫學(xué)方法。這些方法基于特定的單克隆抗體或多克隆抗體具有對(duì)特定霉菌毒素（抗原）的三維結(jié)構(gòu)區(qū)別分類的能力研制而成。這些可以基于免疫親和柱分析法（Immunoaffinity Column-Based Analysis，IAC）或ELISA進(jìn)行。最新方法通常用于商品試劑盒中（黃曲霉毒素試劑盒等，德國(guó)拜發(fā)公司）。

市場(chǎng)上銷售的數(shù)種商業(yè)試劑盒可用于體外檢測(cè)。它們通常是專為檢測(cè)一種霉菌毒素設(shè)計(jì)的，并且明確了應(yīng)用范圍、特異性和交叉反應(yīng)性、準(zhǔn)確性和精密度以及測(cè)量范圍。

在考慮選擇進(jìn)行體外檢測(cè)的試劑盒時(shí)，所有這些參數(shù)很重要。

除ELISA外，快速篩選測(cè)試和許多新技術(shù)（例如生物傳感器）也正在不斷涌現(xiàn)出來。

它們通常由一個(gè)生物來源的識(shí)別元件組成，當(dāng)與目標(biāo)分析物接觸時(shí)，識(shí)別元件會(huì)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件中產(chǎn)生一個(gè)可量化的響應(yīng)。大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制是光學(xué)共振（比色、熒光和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光）、電化學(xué)共振或表面離子體共振。如今，在這些有應(yīng)用前景的技術(shù)中，大多數(shù)技術(shù)還處于開發(fā)階段，并且目前體外霉菌毒素脫毒劑研究還不能用來定量霉菌毒素。

5? 結(jié)論

目前，用脫毒劑來解決霉菌毒素污染問題有很大的發(fā)展?jié)摿?，并且許多體外檢測(cè)方法可用于評(píng)估它們的功效（圖1）。

從單一濃度檢測(cè)到模擬胃腸道更為復(fù)雜的模型，體外試驗(yàn)研究被認(rèn)為是一種有用的預(yù)篩選策略，可以選擇有應(yīng)用前景的吸附材料或產(chǎn)品。