豬TNNC1基因和TNNC2基因在 肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)研究

楊冠青 劉娟 楊陽 蔡春波 趙燕 郭曉紅 曹果清

摘? 要：為了探明肌鈣蛋白不同亞型在肌纖維增殖與類型轉(zhuǎn)變上的作用和分子機(jī)理，本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了TNNC1基因和TNNC2基因在25日齡、70日齡和150日齡三個生長階段的大白豬和山西黑豬的背最長肌、腰肌和股肌中的表達(dá)變化。結(jié)果表明：這兩種基因在大白豬和山西黑豬的三種肌肉組織中均有表達(dá)，但存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異。TNNC1基因在大白豬的背最長肌和腰肌中的表達(dá)存在相似的變化趨勢。在大白豬上，TNNC1基因在25日齡時的背最長肌和腰肌中表達(dá)量最高，在150日齡時的表達(dá)量降到最低水平;在山西黑豬上，TNNC1基因在25日齡時的股肌組織中表達(dá)量較低，而在70日齡時的腰肌、70日齡時的股肌組織、150日齡時的股肌組織中表達(dá)量最高。在大白豬上，TNNC2基因在25日齡時的背最長肌和150日齡時的股肌中表達(dá)量較高;在山西黑豬上，TNNC2基因在70日齡時的腰肌和股肌中表達(dá)量較高。說明TNNC1基因與TNNC2基因在肌纖維發(fā)育與分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可作為檢測肌纖維類型的分子標(biāo)記，為探索豬的肌肉發(fā)育和改善肉品質(zhì)的研究提供理論參考。

關(guān)鍵詞：豬;肌鈣蛋白C亞型1;肌鈣蛋白C亞型2;骨骼肌;基因表達(dá)

肉豬生產(chǎn)是我國畜牧業(yè)的中堅(jiān)產(chǎn)業(yè)，加快肉豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對推進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展、增加農(nóng)民收入以及推動社會進(jìn)步有著重要的影響。我國的肉豬出欄量居世界之首，但生豬生產(chǎn)力還處于比較低的水平。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對豬肉的品質(zhì)及風(fēng)味的要求也越來越高。畜禽肉品質(zhì)的評價指標(biāo)包括嫩度、色澤、風(fēng)味及多汁性等。消費(fèi)者一直把嫩度作為肉質(zhì)評價最主要的指標(biāo)[1]。嫩度以切割肌纖維阻力的大小來判斷。影響肉質(zhì)嫩度的因素有很多，如肌纖維的直徑、肉品質(zhì)、飼喂方式、胴體的儲存方式以及胴體不同部位的組織等[2-3]。

肌鈣蛋白（Troponin，Tn）為鈣離子結(jié)合蛋白多基因家族的成員，在細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)和肌肉收縮等多個細(xì)胞進(jìn)程中都起著關(guān)鍵作用。肌鈣蛋白能夠抑制Ca2+濃度，與肌球蛋白共同調(diào)節(jié)鈣離子對肌動蛋白ATP酶的活性。肌鈣蛋白有3個亞單位，即肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I以及肌鈣蛋白T[4]。脊椎動物有兩種亞型的肌鈣蛋白：慢收縮亞型[Troponin C type 1 （slow），TNNC1]和快收縮亞型[Troponin C type 2 （fast），TNNC2][5]。TNNC2表達(dá)于快收縮骨骼肌，而TNNC1表達(dá)于慢收縮骨骼肌和心肌[6]。TNNC2被鈣離子激活于N-末端的低親和力鈣離子結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和高親和力鈣離子結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ，而TNNC1僅在高親和力的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ處與鈣離子結(jié)合[7]。田興國通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)TNNC2基因僅在豬的骨骼?。ㄈ珉哦^肌、股四頭肌和背最長?。┲斜磉_(dá)，在其他組織中不表達(dá)或者低水平表達(dá)，該基因?qū)趋兰〉纳L、成肌細(xì)胞的分化以及肌肉的收縮起著重要的作用[8]。

新山西黑豬是由馬身豬、內(nèi)江豬、巴克夏豬和杜洛克豬經(jīng)復(fù)雜的雜交選育而育成的品種，與大白豬、長白豬和杜洛克豬等國外品種相比，具有產(chǎn)仔數(shù)多、肉品質(zhì)好以及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究選擇25日齡、70日齡和150日齡三個不同生長階段的大白豬和山西黑豬為研究對象，采用qPCR技術(shù)分析TNNC1基因和TNNC2基因在兩個豬種的肌肉組織中的表達(dá)差異，為研究豬肌肉發(fā)育的分子機(jī)理提供理論參考。

1? 材料

1.1 試驗(yàn)動物

本研究以大白豬和新山西黑豬為試驗(yàn)動物，試驗(yàn)豬統(tǒng)一飼養(yǎng)于山西省鄉(xiāng)寧縣永新康生態(tài)養(yǎng)殖有限公司。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

Mx 7500P 實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司），PCR擴(kuò)增儀（型號：AB9902，美國BIO-RAD公司），超凈工作臺（型號：BCM-1000，蘇州安泰公司），ND-1000微量核酸蛋白測定儀（美國），MLS-3020高溫全自動蒸汽滅菌器（型號：MLS-3020，日本三洋公司），HERMLET 10型勻漿機(jī)（美國），微型臺式冷凍離心機(jī)（型號：Z233MK-2，德國）;DYY-6C型電泳儀（北京），凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），制冰機(jī)（型號：SIM-F124，日本三洋公司），超低溫冰箱（型號：FOMA700，美國）。

1.3 主要試驗(yàn)試劑

Trizol（美國）;cDNA第一鏈合成試劑盒：PrimeScript? RT-PCR Kit（Takara公司）;實(shí)時熒光定量PCR試劑盒：SYBR? PremixEx Taq? II Kit（日本Takara公司）。乙醇和異戊醇等常規(guī)生化試劑均為分析純。

2? 方法

2.1 樣本采集

分別在試驗(yàn)豬25日齡（斷奶）、70日齡（保育期結(jié)束）和150日齡（快速生長期）各屠宰4頭豬（公豬和母豬各2頭），摘取背最長肌、腰肌和股肌的肌肉組織，放入液氮中保存待用。

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI genbank中豬TNNC1基因和TNNC2基因的mRNA信息，以18S為內(nèi)參基因，應(yīng)用Primer 5以及Oligo等軟件設(shè)計(jì)引物，引物委托上海生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

2.3 qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒說明書建議的反應(yīng)條件，以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA進(jìn)行常規(guī)梯度PCR擴(kuò)增，分別篩選內(nèi)參基因和目的基因引物的最佳退火溫度和cDNA模板濃度，確定引物退火溫度后進(jìn)行實(shí)時PCR檢測相應(yīng)引物擴(kuò)增熔解曲線、目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。

2.4 數(shù)據(jù)處理

將RT-PCR所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到EXCEL表格中，采用2-ΔΔCt法計(jì)算每個基因的相對表達(dá)量，使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，同一品種不同組織或不同時間點(diǎn)之間的基因表達(dá)差異采用單因素方差分析，選用鄧肯法進(jìn)行多重比較;不同品種同一組織的基因表達(dá)變化采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。使用GraphPad軟件繪制圖表。

3? 結(jié)果

3.1 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，電泳圖中的條帶整齊，無拖尾現(xiàn)象，長度符合，證明所提取的RNA具有高度的完整性與穩(wěn)定性，可用于后續(xù)的試驗(yàn)操作，結(jié)果如圖1所示。

3.2 TNNC1基因在兩豬種肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)檢測結(jié)果

圖2為TNNC1基因在三個不同日齡大白豬和山西黑豬中的表達(dá)趨勢檢測結(jié)果。試驗(yàn)中，以25日齡大白豬腰肌中TNNC1基因的表達(dá)值作為對照，采用2—ΔΔCt方法計(jì)算該基因在不同日齡的豬的三種肌肉組織中的相對表達(dá)量。

圖2中“①圖”顯示了TNNC1基因在背最長肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC1基因在大白豬背最長肌中的表達(dá)量隨豬日齡的增大呈下降趨勢，在山西黑豬中的表達(dá)量呈現(xiàn)較穩(wěn)定的趨勢。在大白豬上，TNNC1基因在25日齡的表達(dá)量極顯著高于70日齡和150日齡的，150日齡的表達(dá)量最低，極顯著低于70日齡的（P<0.01）。TNNC1基因在25日齡和70日齡的大白豬中的表達(dá)量極顯著高于山西黑豬的，但在150日齡，山西黑豬的表達(dá)量顯著高于大白豬的。

圖2中“②圖”顯示了TNNC1基因在腰肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC1基因在大白豬腰肌中的表達(dá)量隨豬日齡的增長呈下降趨勢，在山西黑豬上的表達(dá)趨勢為先增后減。在大白豬上，TNNC1基因的表達(dá)趨勢與背最長肌的表達(dá)趨勢一致，25日齡最高，70日齡次之，150日齡最低;在山西黑豬上，TNNC1基因在70日齡的表達(dá)量極顯著高于25日齡和150日齡的（P<0.01）。25日齡時，TNNC1基因在大白豬上的表達(dá)量顯著高于山西黑豬的;而在生長后期（70日齡和150日齡），該基因在山西黑豬上的表達(dá)量極顯著高于大白豬的（P<0.01）。

圖2中“③圖”顯示了TNNC1基因在股肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知，在大白豬上，TNNC1基因在豬生長的中前期高水平表達(dá)，150上日齡時的表達(dá)量極顯著下降;然而，在山西黑豬上，TNNC1基因的表達(dá)情況則相反，在豬生長前期（25日齡）表達(dá)量極顯著低于70日齡和? ? ? ? 150日齡時的。在三個采樣點(diǎn)比較兩個豬種的TNNC1基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)豬? 25日齡時，該基因在山西黑豬上的表達(dá)量顯著低于在大白豬上的（P<0.01）;70日齡時，該基因在兩豬種股肌中的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05）;150日齡時，該基因在山西黑豬上的表達(dá)量顯著高于在大白豬上的（P<0.05）。

3.3 TNNC2基因在兩豬種肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)檢測結(jié)果

圖3為TNNC2基因在三個不同日齡大白豬和山西黑豬的表達(dá)趨勢檢測結(jié)果。試驗(yàn)中，以25日齡大白豬腰肌中TNNC2基因的表達(dá)值作為對照，采用2—ΔΔCt方法計(jì)算該基因在不同日齡的豬的三種肌肉組織中的相對表達(dá)量。

圖3中“①圖”顯示了TNNC2基因在豬背最長肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC2基因在大白豬背最長肌中的表達(dá)量隨豬日齡的增長呈下降趨勢，在山西黑豬上的表達(dá)趨勢為生長前期（25日齡和70日齡）的表達(dá)量極顯著低于生長后期（150日齡）的。在大白豬上，TNNC2基因在25日齡時的表達(dá)量最高，極顯著高于70日齡和150日齡時的，其中150日齡時的表達(dá)量最低，且極顯著低于70日齡時的（P<0.01）。TNNC2基因在25日齡和70日齡時的大白豬的表達(dá)量極顯著高于山西黑豬的，但150日齡時在山西黑豬上的表達(dá)量高于大白豬的。

圖3中“②圖”顯示了TNNC2基因在豬腰肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC2基因在大白豬腰肌中的表達(dá)呈現(xiàn)比較穩(wěn)定的趨勢，在山西黑豬上的表達(dá)呈先增后減的趨勢。在大白豬上，TNNC2基因的表達(dá)量在25日齡時達(dá)到最高水平，在? ? ?70日齡和150日齡時較低;在山西黑豬上，TNNC2基因在70日齡時的表達(dá)量極顯著高于25日齡和150日齡時的（P<0.01）。25日齡時，TNNC2基因在大白豬上的表達(dá)量顯著高于在山西黑豬上的，而在豬生長中后期（70日齡和150日齡），TNNC2基因的表達(dá)情況轉(zhuǎn)變?yōu)樵谏轿骱谪i上的表達(dá)極顯著高于在大白豬上的（P<0.01）。

圖3中“③圖”顯示了TNNC2基因在豬股肌中的相對表達(dá)量檢測結(jié)果。由該圖可知，在大白豬上，TNNC2基因在豬生長的中前期（25日齡和70日齡）呈現(xiàn)低水平表達(dá)，而在150日齡時表達(dá)量極顯著升高;在山西黑豬上，該基因在豬生長前期? ? ? ? （25日齡）的表達(dá)量極顯著低于70日齡和150日齡時的。在三個采樣點(diǎn)比較TNNC2基因在兩個豬種上的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)：25日齡時，該基因在大白豬上的表達(dá)量顯著高于在山西黑豬上的（P<0.01）;而70日齡時，該基因在大白豬上的表達(dá)量極顯著低于在山西黑豬上的;150日齡時，該基因在大白豬和山西黑豬的股肌中的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05）。

4? 討論與結(jié)論

早期研究表明TNNC1基因僅在心肌和慢收縮性的骨骼肌中表達(dá)，而TNNC2基因只存在快速收縮性骨骼肌中[9]。但是，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNNC1基因在不同豬種各年齡段的不同肌肉組織中均有表達(dá)，但在腰肌中的表達(dá)量最高，股肌中的最低，說明腰肌含有較高水平的慢肌纖維，而股肌含有較小比例的慢肌纖維。Parmacek和Leiden的研究表明，豬TNNC1基因只在慢肌和心肌中表達(dá)，不會在腦、肺、肝、腎或者睪丸中表達(dá)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)豬TNNC1基因在背最長肌、腰肌與股肌中的表達(dá)趨勢存在差異，表明TNNC1可作為檢測不同類型肌纖維的分子標(biāo)志。

TNNC2基因能夠促進(jìn)豬的肌細(xì)胞分化和骨骼肌生長[6]，被普遍認(rèn)為是肉質(zhì)性狀的潛在候選基因[11]。TNNC2基因的等位基因T能顯著影響豬肉的嫩度和大理石紋，建議將等位基因T作為選育的分子標(biāo)記應(yīng)用于豬的肉質(zhì)選育。由于TNNC2基因通常不在心室肌細(xì)胞中表達(dá)，但在一些疾病中能夠檢測到該基因的異常表達(dá)，因此可將TNNC2基因作為心臟疾病預(yù)測的標(biāo)記[12]。在無脊椎動物中，肌鈣蛋白在肝臟、胰臟、坐骨神經(jīng)、肺和眼等多個組織器官中均有表達(dá)[13]。對藍(lán)塘豬和杜洛克豬肌鈣蛋白C進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)該基因只在眼肌、肱二頭肌和股四頭肌中表達(dá)[14]。在本研究中，TNNC2基因在豬的背最長肌、腰肌和股肌中均有表達(dá)，而且在大白豬的背最長肌和山西黑豬的腰肌中表達(dá)量最高，這與田興國等的研究結(jié)果不一致[14]。

本試驗(yàn)分析了TNNC1基因和TNNC2基因在不同日齡的大白豬和山西黑豬的三種肌肉組織中的表達(dá)差異，結(jié)果表明這兩個基因在不同肌肉中的表達(dá)量上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異，因此它們可作為檢測肌纖維類型的分子標(biāo)記，為探索豬的肌肉發(fā)育和改善肉品質(zhì)的研究提供理論參考。