納豆激酶在血管性疾病防治中的研究進展

劉玉猛 劉英華

摘?要：綜述了納豆激酶的生化特性、防治心血管疾病的功效及應(yīng)用前景，重點闡述了納豆激酶在心血管疾病方面的藥理作用，表明納豆激酶可以作為預(yù)防和治療血管性疾病的膳食補充劑，其作為藥品的開發(fā)前景廣闊。

關(guān)鍵詞：納豆激酶;血管性疾病;溶栓

對于血栓栓塞性疾病，目前臨床上主要是溶栓治療，常用的一些溶栓藥物為鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）等，但這些藥物均不同程度存在副作用大、毒性強、半衰期短、使用不便、價格昂貴等不足。近年來研究發(fā)現(xiàn)，納豆激酶（NK）作為食品或膳食補充劑，具有強烈的溶栓活性，且安全性較高，可作為一種新型溶栓劑研究和開發(fā)。本文綜述NK的生化特征、在血管性疾病中的功效及應(yīng)用的研究進展。

1?納豆激酶的生化特性

NK是一種堿性絲氨酸蛋白酶。20世紀(jì)80年代日本學(xué)者Sumi首次發(fā)現(xiàn)，納豆發(fā)酵過程中形成的納豆菌絲提取物對人工血栓具有溶解作用，并確定其為納豆芽孢桿菌分泌的一種酶，命名為NK[1]。NK氨基酸序列與其他枯草桿菌蛋白酶高度同源，且具有底物專一性，對血漿纖溶酶底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-PNA）最為敏感，對凝血酶底物S-2238（H-d-Phe-Pie-Pip-Arg-pNA）和激肽釋放酶底物S-2302（H-D-Pro-Phe-Arg-pNA）也有一定活性，而對于尿激酶底物S-2444（pyro-Glu-Gly-ArgPNA）和彈性蛋白酶底物S-2484（pyro-Glu-Pro-Val-PNA）沒有作用，由此可見NK在水解蛋白質(zhì)上具有特異性[2]。

影響NK穩(wěn)定性的因素很多，包括溫度、pH、金屬離子和有機化合物等。NK在45 ℃時活性較為穩(wěn)定，高于45 ℃活性明顯下降，55 ℃時活性完全喪失;NK活性幾乎不受低溫影響，反復(fù)凍融5個循環(huán)以后，酶活性仍能保持95%以上。pH值在6.0～9.0之間NK較為穩(wěn)定，低于5.0時穩(wěn)定性較差，其最適pH為7.0[3]。目前已經(jīng)可以通過基因工程技術(shù)改善NK的熱穩(wěn)定性和pH值耐受性，通過點突變技術(shù)獲得的重組NK雙突變體Q59E/N218D熱穩(wěn)定性明顯提高，酶活性保持不變;用酸性或堿性氨基酸替換納豆激酶Ser182和Leu203位點則可以改變重組NK的最適pH值，使其在酸性范圍或堿性范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。NK的活性不受5 mmol/L Cys的影響，乙二胺四乙酸（EDTA）對其有輕微的抑制作用，而蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）能完全抑制其活性[4-5]。金屬離子對于NK活性影響各異：Mn2+和Ca2+具有明顯NK激活作用，金屬離子Hg2+和Cu2+可使其完全失活，Zn2+和Al3+對NK有一定抑制作用，K+和Fe2+則對NK無明顯影響[6]。

2?納豆激酶防治血管性疾病的功效

2.1?預(yù)防血栓形成及溶栓作用

機體內(nèi)纖溶系統(tǒng)功能降低是血栓形成的重要原因之一，而血液的纖溶能力主要取決于血漿t-PA及纖溶酶原激活劑抑制因子-1（PAI-1）的活性[7]。研究發(fā)現(xiàn)，NK可以從多方面發(fā)揮預(yù)防血栓及溶栓作用。

2.1.1?NK具有較強的纖維蛋白溶解活性?NK溶栓的效果要遠大于纖溶酶和彈性蛋白酶，活性是纖溶酶的4倍。NK能夠水解纖維蛋白成多肽和氨基酸，體外實驗證明，把NK提取液加到纖維蛋白平板上時，隨即出現(xiàn)透明溶解環(huán)，溶解環(huán)的大小和酶的活性正相關(guān)，溶栓效果顯著[8]。動物實驗表明，NK在體內(nèi)發(fā)生纖溶作用時，不用通過激活纖溶酶原，而是直接水解交聯(lián)纖維蛋白。其對交聯(lián)纖維蛋白水解活性很強，對纖維蛋白原不敏感，即不會水解血漿中的纖維蛋白原而造成出血傾向。

2.1.2?NK能激活其他纖溶酶尿激酶原和t-PA等?NK能激活尿激酶原使之轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚣っ福g接增強內(nèi)源性纖溶酶量及活性[9]，作用機理可能為：（1）刺激血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生t-PA，t-PA將纖溶酶原激活為纖溶酶，溶解纖維蛋白、降解血栓[10];（2）激活體內(nèi)的尿激酶原轉(zhuǎn)化為尿激酶，尿激酶與t-PA共同激活纖溶酶原，發(fā)揮溶栓效果;（3）降解和失活纖溶酶原激活物抑制劑PAI-1，間接增加尿激酶和t-PA的量，促進血纖維蛋白的溶解。

2.1.3?NK具有一定的抗血小板聚集作用?有研究通過觀察NK對急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)和血小板聚集的影響，發(fā)現(xiàn)其能明顯降低血瘀大鼠的全血粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)等血液流變學(xué)指標(biāo)水平，同時由ADP、凝血酶、花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集也被明顯抑制[11]。人血小板Ca2+動員的體外實驗表明，其抗血小板聚集作用的機制可能在于NK可以顯著提高血小板環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，抑制血小板活化[12]。

2.1.4?NK通過抗炎及抗氧化應(yīng)激防止血栓形成的加速動物和細胞實驗表明，NK可以通過抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的NADPH氧化酶2（NOX2）和Toll樣受體4（TLR4）活化，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的活性氧（ROS）生成和核因子κB（NF-κB）活化，劑量依賴性地降低LPS誘導(dǎo)的炎癥細胞因子水平，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）等，證實NK具有抗炎和抗氧化功效，而越來越多證據(jù)顯示，炎癥、氧化應(yīng)激和凝血之間有強烈的相互作用，NK通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激有效保護了小鼠免受LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷和腎小球血栓的侵害，證實NK可以通過打破炎癥、氧化應(yīng)激和血栓形成之間的惡性循環(huán)，發(fā)揮抗血栓的作用[13]。

2.2?抗凝血作用

動物實驗證實，NK可以通過阻斷內(nèi)、外源性凝血途徑從而抑制凝血活酶的形成，延長凝血活酶時間，并且其在凝血第二階段能夠明顯延長纖維蛋白凝固時間，在凝血的第三階段明顯延長凝血酶時間[14]，意味著NK對整個凝血過程都有一定抑制作用。相關(guān)人群研究也證實，NK在抗凝血方面的特殊功效。在一項人群實驗中，每天給予3組受試者（健康志愿者、有心血管危險因素患者、透析治療患者）2粒NK膠囊（2 000 FU/粒），2個月后發(fā)現(xiàn)所有組中凝血因子Ⅶ、Ⅷ及纖維蛋白原均顯著下降，并且受試者未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)[15]。在另一項包含12例健康男性受試者的雙盲隨機對照研究中也得出相似的結(jié)論，受試者接受單劑量的NSK-SD 2 000 FU或安慰劑，發(fā)現(xiàn)2、4 h時NK受試者血液中抗凝血酶濃度顯著升高，活化部分凝血活酶時間（APTT）明顯延長，凝血因子Ⅷ活性在4、6 h時下降，6、8 h時該組的D-二聚體濃度也顯著高于對照組，但這些變化均處于正常范圍內(nèi)，表明NK的抗凝血活性可能涉及多種不同的途徑，而且不會增加出血風(fēng)險[16]。高膽固醇血癥患者的NK應(yīng)用研究中也觀察到NK與抗凝血作用之間的顯著關(guān)聯(lián)，每天給予高膽固醇血癥患者NK膠囊2 000 FU 8周后，相比于安慰劑對照組，NK組血清中凝血酶原時間（PT）和APTT明顯升高，進一步表明NK在各種人群中均有顯著的抗凝血功效[17]。

2.3?改善血脂及抗動脈粥樣硬化作用

血管的粥樣變化與長期血脂異常密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，NK具有一定的預(yù)防和降低血脂作用。動物實驗結(jié)果顯示，與高脂對照組相比，每天給予NK 280 FU/kg的動脈粥樣硬化模型大鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、動脈粥樣硬化指數(shù)等均顯著下降，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯升高，提示NK具有一定的改善血脂作用[18]。一項NK對頸動脈粥樣硬化和高血脂患者的療效研究中，NK組受試者每天口服NK 6 000 FU，持續(xù)服用26周后，其斑塊面積和頸總動脈中膜厚度明顯下降，同時觀察到NK能顯著降低受試者的TG、TC、LDL-C水平，并有提升HDL-C的作用，但其改善血脂作用與動脈粥樣硬化的改善指標(biāo)沒有正相關(guān)關(guān)系，表明NK改善動脈粥樣硬化作用可能不是直接通過降低血脂水平實現(xiàn)的，可能與其抗炎、抗氧化和溶栓作用有關(guān)[19]。

2.4?抗高血壓作用

NK對高血壓前期患者有一定的降壓作用。在一項北美高血壓人群（收縮壓≥130 mmHg或舒張壓≥90 mmHg）中進行的隨機雙盲安慰劑對照臨床研究中，每天服用NK 100 mg的受試者在8周后，觀察到收縮壓和舒張壓相較于安慰劑組均有降低，而這種降血壓作用對于男性受試者更為顯著[20]。另一項針對亞洲高血壓1期人群的臨床試驗中，NK組（口服NK 2 000 FU/d）收縮壓和舒張壓在干預(yù)8周后比對照組平均降低5.55 mmHg和2.84 mmHg[21]。一項針對自發(fā)性高血壓大鼠的動物實驗對NK的降壓作用進行了研究，通過比較NK和不具有蛋白酶活性的NK衍生片段，發(fā)現(xiàn)NK及其片段通過不同的機制發(fā)揮了降壓作用，進食高劑量NK大鼠（2.6 mg/g飲食）收縮壓、舒張壓和血漿纖維蛋白原水平均顯著降低，而NK片段則抑制了腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性以及血管緊張素Ⅱ濃度升高，表明NK可能是通過裂解血漿中纖維蛋白原發(fā)揮降血壓的作用，其片段則可能是通過抑制血管緊張素Ⅱ來抑制大鼠的血壓升高[22]。其他相關(guān)動物實驗也均得到相似的結(jié)論[23-24]，從而表明NK可被開發(fā)為預(yù)防高血壓和血管性疾病的新型膳食補充劑或功能性食品。

3?納豆激酶在防治血管性疾病的應(yīng)用前景

3.1?納豆激酶安全性

納豆的食用在日本有上千年的歷史，安全性經(jīng)得住檢驗，NK的安全性也在很多研究中得到驗證[25-26]?？诜﨨K后，血中優(yōu)球蛋白溶解時間（ELT）大大降低，優(yōu)球蛋白纖溶活性增強，血栓溶解面積和分解產(chǎn)物增加。國內(nèi)學(xué)者在小鼠NK的毒性檢測試驗中通過大劑量喂食，結(jié)果也并未發(fā)現(xiàn)任何致畸現(xiàn)象[27]。動物實驗顯示，NK靜脈注射會對小鼠血管及周圍組織有強烈刺激作用，大劑量注射則會導(dǎo)致小鼠死亡，原因可能與呼吸中樞抑制及出血有關(guān)，而經(jīng)口大劑量服用NK的小鼠并未發(fā)現(xiàn)死亡及不良反應(yīng)。因此，NK的給藥途徑上，口服給藥安全性更高。但另一方面，在血液中NK的最高安全濃度上，仍然需要大量實驗數(shù)據(jù)來確保臨床應(yīng)用的安全。

3.2?納豆激酶的應(yīng)用劑量

目前開發(fā)的NK制劑主要以口服為主，包括片劑、軟膠囊、硬膠囊、緩控釋制劑等，國際規(guī)定其含量單位為FU/片，國內(nèi)專家建議NK最大攝入量為2 000～2 800 FU/d，35歲以上人群適宜服用[28]，日本營養(yǎng)健康食品協(xié)會規(guī)定的每日正常維持量則在2 000 FU以上。另外，如下人群不建議服用NK：（1）嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、消化不良患者;（2）皮膚、內(nèi)臟器官出血、滲血者;（3）需要促凝藥物治療的患者;（4）治療中已經(jīng)使用大量溶栓藥物者;（5）具有出血性疾病遺傳家族史患者;（6）妊娠及哺乳期婦女;（7）支架術(shù)后患者遵醫(yī)囑執(zhí)行。

4?展望

血栓性疾病在全球范圍內(nèi)高發(fā)，預(yù)防和治療血栓性疾病藥物還具有很大的市場需求，NK在纖溶活性、安全性、成本和持續(xù)時間上都有獨特優(yōu)勢，有望成為治療和預(yù)防血栓性疾病的理想藥物。另外，針對當(dāng)前肆虐全球的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情，柳葉刀等雜志研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重型或危重型新冠肺炎患者存在凝血功能異常，病毒感染機體后，攻擊血管內(nèi)皮細胞，致其損傷并誘發(fā)血管內(nèi)彌漫性凝血，加之患者本身的基礎(chǔ)疾病、激素使用等情況，極易形成血栓，進而導(dǎo)致全身器官衰竭危及生命。即使重癥COVID-19患者經(jīng)治療恢復(fù)后，血管內(nèi)彌漫存在的血栓同樣會增加其靜脈血栓栓塞癥（VTE）的發(fā)生風(fēng)險，留下長期的后遺癥[29-30]。目前針對重型和危重型COVID-19患者VTE的預(yù)防，首推低分子肝素皮下注射的方式，但出血風(fēng)險也相應(yīng)增加。因此，鑒于NK突出的溶栓效果和抗出血傾向的特性，將其作為重型和危重型COVID-19患者VTE的輔助防治方案，具有一定的臨床研究價值。同時，對于康復(fù)期患者，能否通過口服NK促進其康復(fù)，改善其后遺癥狀況，有待進一步研究和探討。

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