氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定生物檢材中鉤吻生物堿

蔡玉剛，張　帆（.四川省瀘州市公安局刑事科學(xué)研究所，四川瀘州646000；.西南醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，四川瀘州646000）

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定生物檢材中鉤吻生物堿

蔡玉剛1，張帆2
（1.四川省瀘州市公安局刑事科學(xué)研究所，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，四川瀘州646000）

目的：利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀建立一種方法，可以有效檢驗(yàn)中毒案件生物檢材中鉤吻生物堿主要成分鉤吻堿子和鉤吻堿甲。方法：利用相似相容原理對(duì)生物檢材中的鉤吻生物堿進(jìn)行液液提取；固相萃取對(duì)有效成分的滯留性對(duì)鉤吻堿進(jìn)行提取，兩種提取方法的優(yōu)越性進(jìn)行評(píng)價(jià)；探索一種對(duì)鉤吻生物堿檢驗(yàn)相適應(yīng)的氣相-質(zhì)譜條件。結(jié)果評(píng)價(jià)：以1μg/mL鉤吻堿甲對(duì)儀器進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)，方法可以滿(mǎn)足檢測(cè)需要。通過(guò)空白添加提取，液液提取和固相萃取的回收率均大于80%，方法均滿(mǎn)足檢驗(yàn)要求。液液提取與固相萃取的平行比較，液液提取的回收率比固相萃取較小，故固相萃取優(yōu)于液液提取。

鉤吻；氣質(zhì)聯(lián)用；固相萃??；液液提取

鉤吻（Gelsemium elegans Benth.），為馬錢(qián)科、鉤吻屬常綠木質(zhì)藤本，別名野葛、胡蔓藤、斷腸草、朝陽(yáng)草等，小枝圓柱形，幼時(shí)具縱棱；除苞片邊緣和花梗幼時(shí)被毛外，全株均無(wú)毛。葉片膜質(zhì)，卵形、卵狀長(zhǎng)圓形或卵狀披針形，種子扁壓狀橢圓形或腎形，邊緣具有不規(guī)則齒裂狀膜質(zhì)翅?；ㄆ?～11月，果期7月至翌年3月。主要功效：破積拔毒，祛瘀止痛，殺蟲(chóng)止癢。鎮(zhèn)痛；鎮(zhèn)靜；抗炎；散瞳；抗腫瘤；毒性。主治疥癩，濕疹，瘰疬，癰腫，疔瘡，跌打損傷，風(fēng)濕痹痛，神經(jīng)痛。全草有毒，有毒成分是鉤吻生物堿，主要有鉤吻堿子（Koumine）、鉤吻堿甲（Gelsemine）、鉤吻堿寅（Kouminicine）、鉤吻堿卯（Kouminidine）、鉤吻堿辰（Kounidine）、鉤吻堿丙（Sempervine）、鉤吻堿?。↘oumicine）、鉤吻堿戊（Koumikine）等，其中含量最高的為鉤吻堿子，其次為鉤吻堿甲。因此，對(duì)生物檢材中鉤吻堿子和鉤吻堿甲成分的檢驗(yàn)是判斷鉤吻中毒的重要途徑。鉤吻堿子和鉤吻堿甲易溶于乙醚、氯仿、乙醇，難溶于水（見(jiàn)圖1～2）。

鉤吻中毒的臨床表現(xiàn)：視中毒藥量大小及種類(lèi)而不同。藥量小者先出現(xiàn)消化系統(tǒng)癥狀，繼而出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，藥量大者可迅速出現(xiàn)昏迷、嚴(yán)重呼吸困難、呼吸肌麻痹室息死亡。多在進(jìn)食即刻及30min發(fā)病。消化系統(tǒng)表現(xiàn)口腔及咽喉灼痛、惡心、嘔吐、腹脹痛、出現(xiàn)腹水。神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)眩暈、眼瞼下垂、吞咽困難、四肢麻木、無(wú)力、肌震顫、言語(yǔ)不清、煩躁不安、昏迷、抽搐、角弓反張、死亡。呼吸、循環(huán)系統(tǒng)表現(xiàn)呼吸先快后慢，不整，呼吸衰竭；心慌，心率先快后慢，心音低，血壓下降。其它表現(xiàn)皮膚變黑、發(fā)熱、瞳孔散大、復(fù)視、視物不清。在現(xiàn)實(shí)鉤吻中毒案件中以錯(cuò)誤使用（內(nèi)服）較多。中毒案件社會(huì)影響比較大，檢驗(yàn)前對(duì)中毒癥狀或者尸體解剖的了解，針對(duì)性檢驗(yàn)可以有效節(jié)約時(shí)間。

圖1　鉤吻堿子

圖2　鉤吻堿甲

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑及標(biāo)準(zhǔn)品

（1）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：鉤吻堿子、鉤吻堿甲；

（2）所用乙醇、乙醚、氯仿等試劑均為分析純。

1.2儀器和設(shè)備

（1）安捷倫7890-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）；

（2）ThermoTDZ5高速離心機(jī)；

（3）振蕩器；

（4）安捷倫簡(jiǎn)易型固相萃取儀。

1.3操作步驟

1.3.1溶液配制

（1）配制濃度均為1mg/mL的鉤吻堿子和鉤吻堿甲的單一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品甲醇或乙醇儲(chǔ)備液，低溫保存，有效期12個(gè)月。

（2）配制10μg/mL鉤吻堿子和鉤吻堿甲的單一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品甲醇或乙醇工作液，低溫保存，有效期6個(gè)月。

1.3.2液液萃取法

取檢材2.0～5.0mL（g），加氫氧化鈉溶液調(diào)pH＞9，2～3倍于檢材的乙醚或氯仿提取2次，合并有機(jī)提取液氮?dú)獯蹈?，?0～200μL甲醇或乙醇溶解供檢。

同時(shí)取等量類(lèi)似空白檢材2份，1份作空白對(duì)照檢材，另1份添加1μg鉤吻堿子作質(zhì)量控制檢材，與檢材平行操作。

1.3.3固相萃取法

（1）固相萃取：

取檢材1.0mL（g）～3.0mL（g），加入2%（v/v）甲醇水溶液3～6mL混勻，超聲或渦旋振蕩5～10min，8000r/min以上離心5～10min，取上清液進(jìn)行固相萃取。洗脫液氮?dú)獯蹈桑?0～200μL甲醇或乙醇溶解供檢驗(yàn)。

同時(shí)取等量類(lèi)似空白檢材2份，1份作空白對(duì)照檢材，另1份添加1μg鉤吻堿子作質(zhì)量控制檢材，與檢材平行操作。

（2）固相萃取條件：

固相柱：以聚苯乙烯-二乙烯基苯-吡咯烷酮或其它類(lèi)似物質(zhì)為固相主要成分。

活化：先后用2～4mL甲醇、2～4mL蒸餾水分別以1～2mL/ min的流速活化柱子；

上樣：以0.5～1mL/min的流速上樣；

洗滌：2～4mL水以1～2mL/min過(guò)柱洗滌雜質(zhì)；

吹干：氮吹10min以上或離心干燥固相柱；

洗脫：1～3mL乙醚以0.5mL/min的流速洗脫。

1.4檢驗(yàn)

GC/MS檢驗(yàn)條件：

色譜柱：非極性或弱極性彈性石英毛細(xì)管柱；

柱溫程序：120℃（2min）10℃/min280℃（12min）；

進(jìn)樣口溫度280℃，傳輸線(xiàn)溫度280℃；

柱流量：恒流1mL/min；

進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣，分流比10～30：1；

離子源：EI；

溶劑延遲3min；

掃描方式：scan模式，質(zhì)量范圍40～550amu。

2　結(jié)果分析

將鉤吻堿子、鉤吻堿甲、1.3.1和1.3.2提取所得的樣品供按1.4的GC/MS條件進(jìn)行分析，鉤吻堿子和鉤吻堿甲標(biāo)準(zhǔn)液的總離子流圖和質(zhì)譜圖（圖3）。所設(shè)檢測(cè)條件下待測(cè)樣品中鉤吻堿子的保留時(shí)間為15.493min，鉤吻堿甲的保留時(shí)間為15.787min，GC/MS質(zhì)譜碎片主要的特征離子峰為：m/z 108（基峰）、m/z 251、m/z 279、m/z 322。其質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)中鉤吻堿子和鉤吻堿甲的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖特征一致（見(jiàn)圖4）。

3　案例應(yīng)用

鉤吻具有藥用價(jià)值但毒性較大，一般僅作外用藥使用，在山區(qū)，每一年都會(huì)有多起由于誤食鉤吻所泡的酒而引起中毒。2013年2月，××省××市110接報(bào)案稱(chēng)：×縣×村有17人因?yàn)楹攘怂幘瞥霈F(xiàn)中毒癥狀，已有一人死亡，其他人正在搶救。筆者親自勘查了該現(xiàn)場(chǎng)，現(xiàn)場(chǎng)提取了喝剩的酒以及17人吃剩的飯菜，及法醫(yī)解剖死者所得的胃內(nèi)容、心血及肝組織。其中喝剩的酒、胃內(nèi)容、心血及肝組織按本文建立的實(shí)驗(yàn)條件通過(guò)GC/ MS分析均檢出了鉤吻堿子和鉤吻堿甲成分。從而認(rèn)定該事件為誤食鉤吻藥酒造成的鉤吻堿中毒的意外事故。

圖3　總離子流圖

圖4　鉤吻堿甲質(zhì)譜圖

4　結(jié)論

本文建立了鉤吻堿中主要成分鉤吻堿子和鉤吻堿甲的GC/MS定性檢驗(yàn)方法，有助于鉤吻堿的日常檢驗(yàn)鑒定，從而為案件的性質(zhì)及偵破提供有力支撐。

TQ450.26

A

2095-2066（2016）25-0267-02

2016-8-20

蔡玉剛（1980-），男，漢族，理化檢驗(yàn)工程師，大學(xué)本科，主要從事理化檢驗(yàn)工作。

張 帆（1983-），男，漢族，法醫(yī)師，大學(xué)本科。

［1］中國(guó)刑事科學(xué)技術(shù)大全·毒品和毒物檢驗(yàn).2003，1（第1版）：353～357.