魚明膠凝膠包埋桉葉精油的控釋及抑菌效果研究

續(xù)庭瑋 周麗萍 閆吉成

摘要：桉葉精油具有廣泛的生物活性，但其易揮發(fā)、運輸與貯存不方便且高濃度的純精油具有腐蝕性，使其應(yīng)用受到了限制。為擴大桉葉精油的應(yīng)用范圍，研究用魚明膠凝膠包埋桉葉精油，并對包埋后的凝膠性質(zhì)進行評價。以魚明膠凝膠的含水率、復(fù)水率、包埋率和抑菌效果為指標(biāo)，探究桉葉精油濃度因素的影響;以釋放率為指標(biāo)，探究pH因素的影響。結(jié)果表明：（1）魚明膠凝膠包埋100 μL桉葉精油時包埋率最高，為96%，隨著包埋的桉葉精油的濃度的增加，包埋率降低;（2）魚明膠凝膠的含水率與復(fù)水率均隨著包埋桉葉精油濃度的不同而出現(xiàn)顯著變化;（3）魚明膠凝膠包埋桉葉精油后的釋放率隨pH的變化而變化明顯，在pH為12時，釋放率最高;（4）桉葉精油被魚明膠凝膠包埋后仍有抑菌效果，并隨包埋桉葉精油的濃度升高而升高。本試驗為桉葉精油的穩(wěn)定性的提高、控制釋放、不良氣味的掩蓋及其在食品抑菌方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桉葉精油;明膠;凝膠;包埋;穩(wěn)定性

桉樹屬桃金娘科，速生樹種，適應(yīng)性強，在我國廣泛種植[1]。桉葉精油是桉樹葉油腺細胞分泌出來的芳香精油，含有大量具有強烈生物活性的有效成分，如酚類、黃酮類、皂甙、甾體、氨基酸、萜類等[2]。桉葉精油對食品中常見的致腐菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉、黑曲霉等均具有一定的抑制性，可將其作為天然安全的抑菌劑添加到食品包裝材料中以延長食品的保鮮期和貨架期[3]。但桉葉精油熱穩(wěn)定性差，常溫下易氧化，香氣成分易揮發(fā)，功效作用持續(xù)時間短，不耐儲藏保存，因此限制了其在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用[25]。

包埋技術(shù)可提高植物精油的穩(wěn)定性、降低植物精油的化學(xué)降解、穩(wěn)定其生物活性，在一定程度上可解決植物精油應(yīng)用所面臨的問題[4]。凝膠包埋作為包埋處理方式之一，可強效提高植物精油的穩(wěn)定性。凝膠是一種高分子聚合物，在特定條件下，體系中的高分子鏈相互交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在溶劑內(nèi)溶脹而不溶解。再加上它具有粘彈性和很好的生物相容性，因此在醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[67]。采用凝膠對桉葉精油進行包埋，可以將液態(tài)的精油轉(zhuǎn)變成固體形式，便于添加到包裝材料中，提高精油的穩(wěn)定性，且利用凝膠的控釋性，可使桉葉精油發(fā)揮長效緩釋抑菌功能。魚明膠是以魚類加工廢棄物——魚皮、魚鱗、魚骨等為原料，由魚膠原蛋白水解得到的一種高分子多肽聚合物[8]。安全無毒并且具有許多優(yōu)良的物理和化學(xué)性質(zhì)的魚明膠已作為海洋資源開發(fā)利用的典范，成為食品加工領(lǐng)域中的重要新材料[9]。但采用魚明膠凝膠包埋植物精油的研究甚少，因此，本研究利用魚明膠制備凝膠，并用其包埋桉葉精油，研究桉葉精油不同的濃度對凝膠性能和精油包埋率及抑菌性能的影響，以期提高桉葉精油的穩(wěn)定性，擴大其應(yīng)用范圍。

1材料與方法

11材料、試劑與儀器

111材料與試劑魚明膠，250 BL60，越南Vinhwellness公司;桉葉精油，分析純，金源天然香料有限公司;瓊脂，食品級，河北亞信生物科技有限公司;氯化鈉，分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;氫氧化鈉，分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;酵母提取物，分析純，安琪酵母股份有限公司。

112儀器與設(shè)備YP601N型電子天平1[準(zhǔn)確度等級（Ⅲ）]，上海精密科學(xué)儀器有限公司;CP224C型電子天平2[準(zhǔn)確度等級（Ⅰ）]，奧豪斯儀器（上海）有限公司;RHKT/C型磁力攪拌器1，IKA Works Guangzhou;EMS12型磁力攪拌器2，天津歐諾儀器儀表有限公司;B260型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠;DHG9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Eppendorf 5810R 型臺式低溫離心機，德國Eppendorf公司;T6新世紀(jì)型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LDZM60KCSⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;KQ300B超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

12方法

121包埋桉葉精油的魚明膠凝膠的制備稱取1 g魚明膠，加入15 mL蒸餾水及5 mL NaOH溶液（01 mol/L），在35℃條件下磁力攪拌12 h[4]使其充分溶解，隨后置于60℃恒溫水浴鍋中加熱30 min。向加熱變性后的魚明膠溶液中分別加入不同濃度的桉葉精油（5、10、15、20、25μL/mL），將混合溶液放入35℃超聲清洗機中超聲30 min，使其形成均一溶液。最后將其放在室溫條件下靜置8 h，形成凝膠。

122凝膠含水率的測定稱取10 g左右樣品記為m1，置于恒重鋁盒中，二者總重記為m2。將盛有凝膠樣品的鋁盒放入105℃烘箱中加熱干燥至恒重，稱得干燥后總重量為m3。計算樣品含水率如式（1）：

含水率=m2-m3m1×100%（1）

123凝膠復(fù)水率的測定準(zhǔn)確稱取重量為m1烘干的魚明膠凝膠成品，置于燒杯中，加入足量的蒸餾水沒過凝膠，靜置復(fù)水24h后，取出凝膠瀝干水分，用吸水紙吸干凝膠表面的自由水，測其重量為m[10]2。

復(fù)水率=m2m1（2）

124桉葉精油包埋率的測定[11]桉葉精油標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：用無水乙醇分別將桉葉精油稀釋為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（1、05、06、068、08 μL/mL）。以無水乙醇為測定背景液，測定桉葉精油標(biāo)準(zhǔn)液在263 nm處的吸光值，以O(shè)D263 nm表示。以桉葉精油的濃度為橫坐標(biāo)、OD263 nm為縱坐標(biāo)，繪制桉葉精油濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。（1）凝膠表面桉葉精油含量測定：將2 mL混有桉葉精油的凝膠制備液倒入直徑2 cm的圓柱形模具中，成膠步驟同121。將凝膠樣品從模具中取出后，用50 mL無水乙醇快速沖洗樣品表面，隨后用無水乙醇將沖洗液定容至100 mL，超聲5 min后，測定該溶液在263 nm處的吸光度，計算樣品表面的桉葉精油濃度c1。（2）凝膠內(nèi)部桉葉精油含量測定：將上述沖洗掉表面桉葉精油的凝膠放入50°C水浴鍋中進行加熱處理，隨后用50 mL無水乙醇提取桉葉精油，并用無水乙醇將提取液定容至100 mL，超聲5 min至溶液均一透明。測定該溶液在263 nm處的吸光度，計算樣品內(nèi)部的桉葉精油濃度c2。

包埋率=c2c1+c2（3）

125桉葉精油釋放率的測定在4個25mL的試管中制備1 g包埋15 μL/mL桉葉精油的魚明膠凝膠待用，制備方法同121。分別配制pH為12[13]、69[14]、76、85[1]的01mol/L的磷酸緩沖溶液，模擬胃腔、口腔、小腸及大腸的pH環(huán)境，將緩沖液各取5 mL分別加到試管中的凝膠上，置于37℃水浴內(nèi)。在不同時間段分別取100 μL的緩沖液（10、40、70、100、130、160 min），用乙醇稀釋25倍后分別測定其在263 nm下的特征吸光值，以表示緩沖液中的凝膠分解釋放桉葉精油的情況[15]。

126包埋桉葉精油的魚明膠凝膠抑菌效果的測定將制備的魚明膠凝膠置于錐形瓶中，在錐形瓶中加入適量去離子水，攪拌均勻，加蓋密封，在超聲波清洗機中于40℃超聲振蕩20 min。再將其轉(zhuǎn)移至裝有數(shù)粒玻璃珠的500 mL圓底燒瓶中，加水至圓底燒瓶中約含300 mL去離子水，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，收集揮發(fā)油測定器中的桉葉精油作為包埋后的桉葉精油備用。在LB固體培養(yǎng)基上接種濃度為10-8CFU/mL的大腸桿菌 并涂布均勻，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。12 h后取出培養(yǎng)皿，用直徑為5 mm的無菌槍頭在培養(yǎng)基上均勻打孔，用無菌鑷子剔去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用無菌移液槍吸取1滴液體培養(yǎng)基封底。然后在孔內(nèi)分別注入100 μL包埋后的桉葉精油，蓋上培養(yǎng)皿蓋后放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑[16]。

13數(shù)據(jù)處理分析

文中試驗數(shù)據(jù)均為3次平行試驗的平均值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。實驗數(shù)據(jù)用 Excel進行統(tǒng)計，采用 Excel 2016 及 Origin 85 軟件進行數(shù)據(jù)整理和回歸分析，并采用Origin 85軟件進行繪圖。

2結(jié)果與分析

21桉葉精油濃度對魚明膠凝膠含水率的影響

如圖1所示，樣品均具有較高的含水率（>96%），桉葉精油添加濃度在0～25 μL/mL的范圍時，對凝膠含水率無顯著影響，這可能是因為魚明膠吸水性能很好，易與水分子形成氫鍵，所以凝膠含水率普遍較高。

22桉葉精油濃度對魚明膠凝膠復(fù)水率的影響

如圖2所示，樣品均具有較高的復(fù)水率（>13）。桉葉精油添加濃度在0～25 μL/mL的范圍時，隨著包埋桉葉精油濃度的提高，凝膠的復(fù)水率整體呈上升趨勢，這可能是因為魚明膠吸水性能很好，所以凝膠復(fù)水性能普遍較高。且桉葉精油在烘干的過程中被揮發(fā)，凝膠內(nèi)部形成空腔[17]，包埋時桉葉精油的濃度越高，烘干后形成的空腔越多，凝膠可吸收的水分越多，復(fù)水率也就越高。

23桉葉精油濃度對魚明膠凝膠包埋率的影響

如圖3所示，樣品均具有較高的包埋率（>92%），且桉葉精

圖3桉葉精油濃度對魚明膠凝膠包埋率的影響油添加濃度在0～25 μL/mL的范圍時，隨著包埋桉葉精油濃度的增加，包埋率呈下降趨勢，主要是因為桉葉精油濃度較高時，魚明膠不能完全包埋桉葉精油，表面油含量很高，導(dǎo)致包埋率降低。

24pH對魚明膠凝膠包埋桉葉精油釋放率的影響

如圖4所示，其中（a）、（b）、（c）、（d）分別為包埋15 μL/mL桉葉精油的魚明膠在pH分別為12、69、76、85時的釋放率隨時間的變化，其中釋放率都隨時間的增加而增加，在pH為12時，釋放率始終最高，這是由于魚明膠本質(zhì)為多肽，強酸有助于加速魚明膠的水解。

25魚明膠凝膠包埋桉葉精油濃度對抑菌效果的影響

如圖5所示，樣品具有良好的抑菌性能，且桉葉精油添加濃度在0～25 μL/mL的范圍時，抑菌圈直徑隨包埋的桉葉精油的濃度的升高而增大，這是由于桉葉精油的抑菌性能與其成分及成分含量有一定的關(guān)系，桉葉精油中的主體成分萜烯類、醇類、酚類等物質(zhì)均具有一定的抑菌作用，因此桉葉精油包埋的濃度越高，凝膠的抑菌性能越好[18]。

3結(jié)論

（1）魚明膠凝膠包埋桉葉精油后會對魚明膠凝膠的含水率和復(fù)水率有一定的影響，若實際生產(chǎn)中這兩個因素對生產(chǎn)結(jié)果影響較大，需要考慮包埋的桉葉精油的濃度對含水率和復(fù)水率的影響。（2）魚明膠凝膠包埋5 μL/mL桉葉精油時包埋率最高，隨著包埋的桉葉精油的濃度的增加，包埋率降低，在實際生產(chǎn)中需考慮經(jīng)濟效益，避免浪費，可選擇包埋較低濃度的桉葉精油。（3）魚明膠凝膠包埋桉葉精油后的釋放率隨pH的變化而變化明顯，在pH分別為12、69、76、85時，pH為12時釋放率最高，說明若制作成可食用凝膠使用時，在胃中釋放率最高，使用過程中可適當(dāng)延長咀嚼時間，增大桉葉精油的利用率。因為隨著時間的延長，在pH為76時也可以達到較高的釋放率，所以也可在開發(fā)可食用凝膠時，適當(dāng)對成分進行改造，使其在小腸停留較長時間。（4）桉葉精油被魚明膠凝膠包埋后仍有抑菌效果，并隨包埋桉葉精油的濃度升高而升高。以魚明膠凝膠對桉葉精油進行包埋，可提高其穩(wěn)定性，同時可實現(xiàn)桉葉精油的緩釋抑菌效果，使其便于作為天然食品抑菌保鮮劑使用。

本研究探討了桉葉精油的包埋濃度對魚明膠凝膠的各項凝膠特性的影響，不同材料的凝膠包埋桉葉精油后凝膠性質(zhì)的變化和對桉葉精油性質(zhì)的影響及新的包埋方式還有待研究。凝膠包埋精油的研究方向也可應(yīng)用于其他精油，因為一般來說，各類精油的揮發(fā)率較高，凝膠包埋精油可以提高精油的穩(wěn)定性，便于運輸或掩蓋氣味[1920]。◇

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