曲霉降解玉米秸稈制備燃料乙醇的工藝研究

柴成朋 張宏坤

摘要： ?燃料乙醇作為新型能源的替代品，近年來備受世界各國的青睞。而使用豐富且低廉的玉米秸稈資源代替供應糧制備燃料乙醇，這在很大程度上減輕了國內(nèi)糧食供應不足的現(xiàn)狀，與此同時，它也能夠推動國家經(jīng)濟發(fā)展，并降低焚燒過程對環(huán)境污染所造成的負面影響。在這里本實驗團隊采用玉米秸稈作為生產(chǎn)燃料乙醇的原料，它不僅成本低，而且生長周期短、易于獲得。玉米秸稈主要成分是由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素組成，此外還含有灰分、少量的蛋白質(zhì)。而木質(zhì)素與纖維素在空間上會通過共價鍵形成特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此在水解過程中會很大程度上較低水解的活性。因此，在這里本實驗團隊采用酸性高溫條件下進行水解，使其克服共價鍵斷裂所需的能壘形成單糖，并利用直接滴定法測定酸性條件下不同溫度條件下還原糖含量，實驗結(jié)果表明，得出在酸性條件下，增加水解溫度可以加快多糖的水解開環(huán)，形成新的游離羥基，使纖維素的結(jié)晶度降低進而轉(zhuǎn)化為單糖 。只有將玉米秸稈中纖維素與木質(zhì)素充分降解為還原糖，才能夠使其在低酸性條件下進行菌株發(fā)酵制備燃料乙醇。這樣不僅很大程度上保護了菌株發(fā)酵的活性，而且使能還原糖高效的轉(zhuǎn)化為燃料乙醇。利用氣相質(zhì)譜分析的方法，通過質(zhì)譜碎片峰與總離子流圖結(jié)合分析，確定產(chǎn)物中含有乙醇分子

關(guān)鍵詞：玉米秸稈;氣相色譜—質(zhì)譜;燃料乙醇;還原糖;曲霉

針對玉米秸稈中木質(zhì)素與纖維素在空間上通過共價鍵形成的特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加之不同的纖維素存在著不同的晶體結(jié)構(gòu)、以及原料內(nèi)孔面積，這將使在水解過程中需要消耗很多能量才能克服斷裂共價鍵所需的活化能[1-3]。所以，如何選取有效的水解玉米秸稈的方案將成為一個首要解決的問題，在傳統(tǒng)過程中，常采用酶解、物理爆破、低酸度水解的方案去處理玉米秸稈，這在很大的程度上都不能徹底將玉米秸稈水解，因此，本實驗采用強酸高溫水解的方法進行對玉米秸稈水解。其中采用控制不同溫度水解的方法是本研究的一個亮點[4-6]。實驗數(shù)據(jù)表明，在相同時間作用下，通過控制不同水解溫度對玉米秸稈進行水解，可以得出在在高溫條件下可以加快多糖的水解開環(huán)，產(chǎn)生新的游離羥基，使纖維素的結(jié)晶度降低進而轉(zhuǎn)化為單糖。同時，該反應是吸熱反應，根據(jù)勒夏特列原理，升高溫度有利于反應的正向進行，進而又一步印證了纖維素水解的反應速率與升溫有關(guān)。

欲將水解產(chǎn)物進行菌株發(fā)酵，就需控制較小酸度才能使菌株存活下來，從而使菌種在更好的條件發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。在傳統(tǒng)的釀酒工藝中會常常加入酒曲，以提高酒的產(chǎn)量和香醇度，該種菌在水解液中可以更好的捕捉糖分進行發(fā)酵。曲霉一般可通過土豆為載體進行培養(yǎng)純種，選取長勢較好的2-4個單菌落進行分離純化?？梢岳梦⑸镒詣予b定儀進行觀察菌株的分布與長勢。根據(jù)后續(xù)實驗可以得出曲霉存在種間優(yōu)勢，且繁殖快，對生長環(huán)境不是很苛刻，進而證明了曲霉在發(fā)酵制備燃料乙醇的過程中為最佳菌株[7-10]。

一、實驗材料與方法

（一）實驗材料

玉米秸稈取自農(nóng)田、酒曲購買于安琪公司

（二）實驗儀器

氣相—質(zhì)譜聯(lián)用儀、錐形瓶、量筒、燒杯、漏斗、容量瓶、電子天平、移液管、電爐、酸式滴定管

（三）實驗試劑

濃硫酸、0.1%的葡萄糖標準溶液、菲林甲乙試劑、亞甲基藍指示劑

二、實驗方法

（一）直接滴定法測定還原糖

1.空白滴定

準確移取各5.00mL菲林甲、乙試劑于250mL錐形瓶中，加入約8mL葡萄糖標準溶液，搖勻，置于電爐上進行加熱至沸騰，以每1-2s一滴的速度滴入葡萄糖標準溶液中，直至藍色消失，記錄消耗的葡萄糖標準溶液的總體積（V0）

2.直接滴定

稱取5g粉碎的玉米秸稈置于五個平行的燒杯錐形瓶中，依次加入不同酸度的濃硫酸溶液，水浴加熱至65，在錐形瓶上放置表面皿（以免加熱過程中水分流失，增大還原糖濃度，影響測量結(jié)果），水浴時間為1小時，之后冷卻至室溫，將玉米秸稈的水解液通過漏斗過濾至錐形瓶中密封保存?zhèn)溆?，滴加堿液使PH調(diào)至中性。將待測溶液分別移取1mL置于250mL的錐形瓶中，準確移取菲林甲乙試劑各5.00mL加入其中，搖勻，之后置于電爐上加熱至沸騰，以每1-2s一滴的速度滴加標準葡萄糖溶液，直至溶液藍色消失，記錄消耗葡萄糖標準溶液體積（V1）

（二）菌株發(fā)酵制備燃料乙醇

通過直接測定法，得到水解效果較好的酸度，將已經(jīng)水解好的樣品調(diào)解PH至中性，準確稱量0.5g酒曲桿菌加入至錐形瓶中，用膠塞將瓶口密封，進行無氧呼吸?？刂扑囟葹?5，水浴時間為72個小時，之后將水浴樣品置于陰涼處，避免光線直射，72h后就可以獲得發(fā)酵好的乙醇溶液，再通過蒸餾裝置將所需的乙醇溶液從混合發(fā)酵溶液中分離出來。

三、結(jié)果與討論

（一）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析樣品液中乙醇分子

在氣相色譜儀部分，采用毛細管開管柱可以消除渦流擴散，同時管壁上的液膜很薄，也可以極大地降低固定相傳質(zhì)，所以單位柱長的柱效高，有利于分析較為復雜樣品，而在質(zhì)譜部分，則采用四極桿質(zhì)量分析器，通過改變射頻電壓振幅比率或射頻頻率以實現(xiàn)質(zhì)量掃描，讓質(zhì)荷比不同的離子可以依次抵達檢測器，其分辨率很高，且對樣品分析很快根據(jù)分子特殊離子碎片，麥氏重排離子，就可以在譜庫檢索中查到質(zhì)譜圖上的分子，同時與總離子流圖比對分析，通過圖1-1和1-2可以得知，在峰A處為乙醇分子峰。

（二）不同溫度下對玉米秸稈水解的測定結(jié)果

在一定酸度條件下，控制時間變量，進行測定不同溫度條件下對水解率的影響，測定結(jié)果見表1-1、圖1-3。

在玉米秸稈中，纖維素會在空間上通過特殊的共價鍵相互連接，而想要斷裂共價鍵就得需要克服很大的能壘，才會使多糖開環(huán)，產(chǎn)生游離的羥基，加快水解速率，從圖1-3可知，在相同時刻下，溫度升高可以促進玉米秸稈水解，由此可見，溫度的升高對水解速率成正比，綜合各種因素，從節(jié)能角度和可行性考慮，水解最佳溫度為100℃。

（三）測定消耗殘?zhí)橇坑谝掖籍a(chǎn)量之間測定結(jié)果

在無氧條件下，對酒曲桿菌消耗培養(yǎng)基中的還原糖進行測定，推斷水解液中還原糖在菌株作用下，殘?zhí)呛颗c乙醇產(chǎn)生之間的關(guān)系。實驗測定結(jié)果見表1-2和圖1-4。

如圖1-4所示，酒曲桿菌在無氧呼吸作用下，它會捕捉培養(yǎng)基中的還原糖補充自身的養(yǎng)分，進行繁殖產(chǎn)生更多的后代，隨著發(fā)酵時間增加，殘?zhí)橇繒掷m(xù)降低，而自身無氧呼吸的產(chǎn)物會持續(xù)升高，他們之間存在著反比關(guān)系。

（四） 培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對乙醇產(chǎn)量測定結(jié)果

在不同時間段內(nèi)，依次利用移液槍從發(fā)酵液中取出5mL樣品，進行過濾處理，之后將處理好的樣品送入氣相色譜，測定乙醇的含量，數(shù)據(jù)可見表1-3

從圖1-5可知，當葡萄糖含量達到90g/L時，乙醇的產(chǎn)量達到峰值，隨著葡萄糖含量的繼續(xù)增加，溶液中的滲透壓持續(xù)升高，導致發(fā)酵過程中酒曲桿菌不能有效的進行無氧呼吸，產(chǎn)生乙醇。所以可以得出，在葡萄糖含量達到90g/L的條件下為最適宜的發(fā)酵條件。

（五）菌落前期培養(yǎng)的競爭結(jié)果

從圖1-6中可以看出曲霉、毛霉、根霉、孢霉的生長分布，而曲霉在繁殖過程中存在種間優(yōu)勢，繁殖數(shù)量最多且繁殖速率最快，而其他菌種的競爭能力較小，且對生存條件較為苛刻，所以綜上所述，曲霉是最佳菌種。

四、結(jié)論

（一）玉米秸稈的最佳水解溫度的確定

在酸性條件下，針對玉米秸稈進行水解實驗，可得出結(jié)論，隨著水解液的溫度不斷提升，可以加快玉米秸稈中纖維素之間共價鍵的斷裂，迫使游離的羥基裸露出來，增加親水性，進而降低了纖維素的結(jié)晶度，加快多糖的開環(huán)產(chǎn)生單糖。

（二） 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的測定

利用氣相色譜的在確定的溫度條件下，樣品在惰性的流動相與毛細管柱之間不同分配比的差異，使樣品可以通過沸點高低的不同，先后從色譜柱中流出，通過接口部分將樣品流入離子源形成帶電離子，同時要控制接口的溫度要稍低于柱溫，之后在質(zhì)譜儀部分利用不同的質(zhì)荷比分析出樣品，通過以上操作，本團隊成功的檢測樣品中含有乙醇分子。

（三）最佳菌種選擇

通過多天菌株的培養(yǎng)，本實驗團隊從各種菌種中塞選出長勢最佳的菌株，酒曲霉素是一種兼性厭氧型菌株，它可以通過無氧呼吸降解培養(yǎng)液中的還原糖產(chǎn)生燃料乙醇，根據(jù)沸點不同的特性，則采用蒸餾的方法將其溫度控制在78-79度沸點之間，獲得所需的餾分燃料乙醇。

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基金項目：黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（201910234016）

作者簡介：

張宏坤 （1979-）， 男，黑龍江海倫人，副教授，博士，主要從事有機與高分子材料合成研究工作。