基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的畬藥“十二時(shí)辰”治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究

曾熙穎　張?jiān)啤∽蟠禾m　林凡

【摘 要】 目的：分析畬藥“十二時(shí)辰”治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的有效成分及可能作用機(jī)制。方法：通過(guò)文獻(xiàn)挖掘并利用TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取畬藥“十二時(shí)辰”的已知化學(xué)成分和相關(guān)靶點(diǎn);將獲得的靶點(diǎn)信息與DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中抗RA藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，分析藥物治療RA的可能性;利用Cytoscape軟件分別構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和“十二時(shí)辰抗RA靶點(diǎn)-人體蛋白”蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);利用David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集和KEGG分析，分析藥物治療RA的可能分子機(jī)制。結(jié)果：畬藥“十二時(shí)辰”含有油酸、棕櫚酸、齊墩果酸、十五烷酸等潛在抗RA化合物，潛在抗RA關(guān)鍵靶點(diǎn)為前列腺素G/H合成酶1、2和凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2等;GO結(jié)果提示其治療RA的基因功能主要體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等方面;KEGG結(jié)果暗示主要相關(guān)信號(hào)通路有TNF、PI3K-Akt、Rheumatoid arthritis、Toll樣受體和MAPK等信號(hào)通路。結(jié)論：畬藥“十二時(shí)辰”可能通過(guò)多靶點(diǎn)、多信號(hào)途徑的相互作用，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的異常增殖，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療RA的作用。

【關(guān)鍵詞】 畬藥“十二時(shí)辰”;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

【中圖分類號(hào)】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2020）14-0038-09

Network Pharmacological Approach to Investigate Mechanismin She Medicine

Clematis florida Thunb. var. plena D. Donfor Rheumatoid Arthritis

ZENG Xiying1 ZHANG Yun2 ZUO Chunlan3 LIN Fan1*

1. College of Integrative Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;

2. Department of Science Research， Fujian Institute of Education， FuZhou 350025， China;

3. Fujian Academy of Integrative Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China

Abstract：Objective To analysis the active compounds and possible mechanismsof She medicine Clematis florida Thunb. var. plena D. Don in the treatment of rheumatoid arthritis （RA）. Methods Through the literature mining and using the TCMSP database，the known chemical compounds and related targets of Clematis florida Thunb. var. plena D. Don were obtained. Then， the targets of FDA-approved anti-RA drugs and the human protein interaction data were obtained from database of DrugBank and HPRD， respectively. Cytoscape software was used to establish chemical compounds-targetnetwork and anti-RA targets of Clematis florida Thunb. var. plena D. Don-human proteinPPInetwork， which were analysised network topology. The David database was used for GO enrichment and KEGG analysis to analyze the possible molecular mechanisms. Result She medicine Clematis florida Thunb. var. plena D. Don contained potential anti-RA compounds such as oleic acid， palmitic acid， oleanolic acid and pentadecanoic acid.Potential targets for this effect were prostaglandin G/H synthase 1 （COX-1）， prostaglandin G/H synthetase 2 （COX-2） and apoptosis regulator Bcl-2. The GOenrichmentresults suggested that the gene function of anti-RA was mainly reflected in inflammatory response， negative regulation of apoptotic process， positive regulation of NF-kappaB transcription factoractivity and protein homodimerization activity. The results of KEGG analysis showed that the drug-resistant RA-related signaling pathway were mainly TNFsignaling pathway，PI3K-Aktsignaling pathway， rheumatoid arthritis signaling pathway， Toll-like receptorssignaling pathway， MAPK signaling pathway and so on.Conclusion Our results indicated that active compoundsin Clematis florida Thunb. var. plena D. Donmight interact synergistically with multiple targets and signaling pathways to inhibitabnormal proliferation of fibroblast-like synoviocytes， reduce inflammatory responses， and treat rheumatoid arthritis.

Keywords：She Medicine Clematis florida Thunb.var. plena D. Don;Rheumatoid Arthritis;Network Pharmacology;Action Mechanism

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種常見(jiàn)慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，可引起骨損傷以及殘疾。該疾病的發(fā)病率為0.03%，高發(fā)年齡段為35歲至50歲之間[1]。目前，RA的病因尚未完全清楚[2]，其病程遷延，呈慢性、侵襲性發(fā)展，復(fù)發(fā)率與致殘率高，易引發(fā)心血管疾病和其它并發(fā)癥，從而損害患者的生活質(zhì)量[3]。RA的主要治療藥物為以甲氨蝶呤為代表的抗風(fēng)濕藥物和腫瘤壞死因子α（TNF-α）抑制劑為代表的生物制劑，單獨(dú)或聯(lián)合用藥可減輕關(guān)節(jié)腫脹和疼痛、改善多種臨床癥狀，但目前尚無(wú)治愈性治療方案[4]。另一方面，胃腸和心臟毒性、注射部位感染、結(jié)核病和淋巴瘤患病風(fēng)險(xiǎn)的增加等毒副作用限制了抗RA藥物的使用[5]。同時(shí)，有許多患者對(duì)現(xiàn)有治療方法沒(méi)有反應(yīng)[6]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的有效療法。

畬藥“十二時(shí)辰”是毛茛科鐵線蓮屬重瓣鐵線蓮（Clematis florida Thunb.var. plena D. Don）的干燥根[7]，其味辛，性溫，具有通關(guān)竅、通經(jīng)活絡(luò)、活血止痛、祛風(fēng)除濕等功效[8]，是一味頗具地方特色的閩東畬藥。RA在中醫(yī)屬“痹癥”范疇，《素問(wèn)·痹論》中提及“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹”，治療的基本原則為“風(fēng)者疏之，寒者溫之，濕者驅(qū)之”，常用散風(fēng)、驅(qū)寒、祛濕等性質(zhì)的中藥治療[9]，而祛風(fēng)除濕正是“十二時(shí)辰”的常用功效之一。另外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎急性期常呈現(xiàn)滑膜血管水腫、滲出性和細(xì)胞浸潤(rùn)性病變，繼而導(dǎo)致腫脹疼痛，這些癥狀與“十二時(shí)辰”的主治相符。因此“十二時(shí)辰”對(duì)于RA可能具有療效。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)“十二時(shí)辰”抗RA的有效成分及作用機(jī)制進(jìn)行全面探討，闡釋其治療RA的可能機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論支撐，拓展該藥的應(yīng)用范圍。另一方面，該研究成果將有利于弘揚(yáng)和繼承畬醫(yī)藥文化，推動(dòng)畬醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 獲取“十二時(shí)辰”化學(xué)成分 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)）[10]（http：//www.megabionet.org/tcmid/search/）收集“十二時(shí)辰”的主要化學(xué)成分，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘[11-13]并利用Pub Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，確定“十二時(shí)辰”的已知化學(xué)成分。

1.2“十二時(shí)辰”靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與RA疾病靶點(diǎn)查詢 利用TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)獲取上述化學(xué)成分的靶點(diǎn)。將篩選得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）中進(jìn)行檢索和轉(zhuǎn)換操作，得到與相關(guān)的靶蛋白或靶基因信息。

1.3“十二時(shí)辰”靶點(diǎn)與抗RA作用的相關(guān)性分析 將查詢得到的“十二時(shí)辰”預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息與DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的抗RA藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射分析，分析“十二時(shí)辰”預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與抗RA作用相關(guān)性。

1.4“十二時(shí)辰化學(xué)成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 3.7.1軟件，將檢索到的“十二時(shí)辰”化學(xué)成分與其在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的潛在靶點(diǎn)生成“十二時(shí)辰化學(xué)成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。

1.5 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 從HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.hprd.org/）中獲取人體蛋白互作數(shù)據(jù)作為背景網(wǎng)絡(luò)[14]。利用1.3分析得到的“十二時(shí)辰”抗RA相關(guān)靶點(diǎn)與人體蛋白互作數(shù)據(jù)生成“十二時(shí)辰抗RA靶點(diǎn)-人體蛋白”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。

1.6“十二時(shí)辰”抗RA靶點(diǎn)的GO功能富集和KEGG通路注釋分析 采用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)所預(yù)測(cè)的“十二時(shí)辰”抗RA靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能富集和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路注釋分析。

2 結(jié)果

2.1“十二時(shí)辰”化學(xué)成分的獲取 通過(guò)文獻(xiàn)檢索、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到“十二時(shí)辰”的化學(xué)成分共9種，各化學(xué)成分的基本信息見(jiàn)表1。從表中可見(jiàn)，在9種化學(xué)成分中，除齊墩果酸為皂苷類化合物外，其余8種均為揮發(fā)油成分。

2.2 “十二時(shí)辰”化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)信息及其治療RA的可行性分析 “十二時(shí)辰”的9種化合物共檢索到60個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。將“十二時(shí)辰”的潛在作用靶點(diǎn)與DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的1848個(gè)抗RA藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，結(jié)果得到21個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)。這21個(gè)靶點(diǎn)占“十二時(shí)辰”總靶點(diǎn)數(shù)目的35%，提示“十二時(shí)辰”可能具有治療RA的功效，其基本信息（包括靶蛋白、靶基因、Uniprot號(hào)和頻次）見(jiàn)表2。其中凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2（Apoptosis regulator Bcl-2）和前列腺素G/H合成酶1（Prostaglandin G/H synthase 1）在9個(gè)化合物中出現(xiàn)頻次均為5，前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H synthase 2）的頻次為4，提示它們可能具有重要作用。

2.3“十二時(shí)辰化學(xué)成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò) 將9個(gè)化合物及其潛在的靶點(diǎn)相連以構(gòu)建“十二時(shí)辰化學(xué)成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。該網(wǎng)絡(luò)包括68個(gè)節(jié)點(diǎn)（8個(gè)化合物和60個(gè)潛在靶點(diǎn)）和83條邊，而正二十一烷在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)靶點(diǎn)，故在構(gòu)建的分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有顯示。在網(wǎng)絡(luò)中，連接化合物和靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)可能起到重要的作用，是潛在的關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)。表3列舉了“藥物分子-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)信息，即分子1308（油酸）有最多的潛在靶點(diǎn)（21個(gè)），其次是分子0069（棕櫚酸）、分子1396（十五烷酸）、分子0263（齊墩果酸）分別有17、16、12個(gè)潛在靶點(diǎn)，提示它們可能是起關(guān)鍵作用的藥物分子。另外，度值（網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)）較高的靶點(diǎn)為凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2（P10415）、前列腺素 G/H合成酶1（P23219）、前列腺素G/H合成酶2（P35354），分別有5、5、4個(gè)相互作用配體，并且通過(guò)與表1比對(duì)可發(fā)現(xiàn)這三個(gè)靶點(diǎn)均存在于映射得到的21個(gè)“十二時(shí)辰”與RA共同靶點(diǎn)中，提示Bcl-2、PTGS1、PTGS2等是“十二時(shí)辰”活性成分治療RA的主要靶點(diǎn)群。此外，在分子1308（油酸）作用靶點(diǎn)中包含關(guān)鍵靶點(diǎn)前列腺素 G/H合成酶1（P23219）和前列腺素G/H合成酶2（P35354）;在分子0069（棕櫚酸）和分子1396（十五烷酸）作用靶點(diǎn)中則均包含以上3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

另外，網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：網(wǎng)絡(luò)集中度為0.299，網(wǎng)絡(luò)密度為0.038，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.594，最短路徑為2808（67%），節(jié)點(diǎn)平均中介中心度為0.044，大于平均中介中心度的節(jié)點(diǎn)有10個(gè)。這說(shuō)明“十二時(shí)辰”中含有的化合物可能作用于整個(gè)生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，而非單一作用于某一個(gè)蛋白靶點(diǎn)，從而提示了“十二時(shí)辰”作用的整體性和復(fù)雜性。

2.4“十二時(shí)辰抗RA靶點(diǎn)-人體蛋白”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 以HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的人體蛋白互作數(shù)據(jù)作為背景網(wǎng)絡(luò)，與21個(gè)“十二時(shí)辰”抗RA靶點(diǎn)，構(gòu)建“十二時(shí)辰抗RA靶點(diǎn)-人體蛋白”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。各靶點(diǎn)相應(yīng)的度值見(jiàn)表4，根據(jù)表格可發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)Bcl-2、前列腺素 G/H合成酶1和前列腺素G/H合成酶2的度值排名均較靠前，結(jié)合2.3進(jìn)一步證實(shí)了這3個(gè)靶點(diǎn)在“十二時(shí)辰”治療RA中具有重要作用。

2.5 “十二時(shí)辰”抗RA靶點(diǎn)的GO功能富集和KEGG通路注釋分析 利用DAVID平臺(tái)的GO和PATHWAY模塊對(duì)所預(yù)測(cè)的“十二時(shí)辰”抗RA靶點(diǎn)進(jìn)行研究。在GO富集分析中，確定了38個(gè)GO條目（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，F(xiàn)DR<0.05），如圖3所示。其中生物過(guò)程相關(guān)條目有22個(gè)，涉及炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性正調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)等方面;分子功能相關(guān)條目9個(gè)，涉及蛋白質(zhì)同源二聚化活性、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合等方面;細(xì)胞組成相關(guān)條目7個(gè)，涉及細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等方面。

在KEGG通路注釋分析中，篩選出顯著的前20條通路（P<0.05），其中與RA關(guān)系密切的通路有5條（見(jiàn)表5）。在PI3K-Akt、Rheumatoid arthritis和Toll-like receptor這三條信號(hào)途徑的作用位點(diǎn)中均包含凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2（P10415）;TNF 信號(hào)途徑的作用位點(diǎn)包含前列腺素G/H合成酶2（P35354）;MAPK信號(hào)途徑的作用位點(diǎn)包含前列腺素 G/H合成酶1（P23219）。提示“十二時(shí)辰”可能通過(guò)作用于這5條通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)而發(fā)揮抗RA的作用。

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)中炎性細(xì)胞的積累導(dǎo)致持續(xù)性滑膜炎及骨質(zhì)破壞為特征的自身免疫性疾病[2]，這與畬藥“十二時(shí)辰”在治療關(guān)節(jié)腫痛中所表現(xiàn)的炎癥充血和滲出反應(yīng)有相似之處。中醫(yī)治療RA時(shí)常用具有驅(qū)寒、散風(fēng)、祛濕等性質(zhì)的中藥[9]，而祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛恰是“十二時(shí)辰”及其同屬植物的常用功效之一，如：黃花鐵線蓮（Clematis intricata Bunge）可被用于治療RA[14]，威靈仙（Clematis chinensis Osbeck.）總皂苷對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有較好療效[15]，單葉鐵線蓮（Clematis henryi Oliv.）對(duì)II型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠能緩解癥狀和改善病變，對(duì)RA有防治作用等[16]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析得出“十二時(shí)辰”的9種化學(xué)成分和60個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中35%潛在靶點(diǎn)與現(xiàn)有抗RA藥物靶點(diǎn)重合，提示“十二時(shí)辰”可能具有治療RA的功效。

對(duì)“十二時(shí)辰化學(xué)成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析表明，“十二時(shí)辰”的關(guān)鍵化合物有油酸、棕櫚酸、齊墩果酸和十五烷酸。不飽和脂肪酸具有降低血栓形成、降低血小板黏附及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[17]。油酸和棕櫚酸作為不飽和脂肪酸，可能在抗炎過(guò)程中起到減少血栓形成和抗氧化的作用。裴克等利用小鼠實(shí)驗(yàn)證明油酸和棕櫚酸具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[17];其中棕櫚酸可能通過(guò)降低Bcl-2表達(dá)水平[18-20]，激活MAPK信號(hào)通路，活化p38、JNK、ERK，引起前列腺素G/H合成酶的表達(dá)升高[21]來(lái)發(fā)揮作用。齊墩果酸為五環(huán)三萜類化合物，具有多種藥理活性，體內(nèi)外研究表明齊墩果酸具有顯著的抗炎活性[22-24]，它對(duì)IL-6、IL-8和MMP1等炎癥因子的表達(dá)有明顯的抑制作用，能明顯地抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、p38、c-jun N末端激酶和Akt蛋白的磷酸化，抑制IκB-α蛋白的降解[25]。

對(duì)“十二時(shí)辰化學(xué)成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析還表明，“十二時(shí)辰”潛在抗RA關(guān)鍵性靶點(diǎn)為前列腺素G/H合成酶1、前列腺素G/H合成酶2和凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2等。炎癥反應(yīng)和成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）的異?；罨鲋呈荝A發(fā)病的關(guān)鍵因素[26]。前列腺素G/H合成酶1、2又分別稱為COX-1和COX-2，其中COX-1與炎癥的發(fā)生有密切的關(guān)系，COX-2參與加劇炎癥進(jìn)程[27]。有研究表明，通過(guò)抑制COX-2 表達(dá)和PGE2的合成，可減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制FLS細(xì)胞增殖，從而治療RA[28-29]。另外，凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2的異常表達(dá)也可影響FLS的增殖/凋亡進(jìn)而影響RA的病理過(guò)程。如體外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA模型細(xì)胞中Bcl-2水平明顯升高[30]。甲氨蝶呤等抗RA藥物的作用機(jī)制亦與降低Bcl-2表達(dá)水平相關(guān)[31-32]。這些報(bào)道的結(jié)果均與本研究結(jié)果相符。

進(jìn)一步利用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)21個(gè)“十二時(shí)辰”潛在抗RA靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路注釋分析。GO結(jié)果提示“十二時(shí)辰”治療RA相關(guān)基因功能主要體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等方面;KEGG結(jié)果表明“十二時(shí)辰”可能通過(guò)TNF信號(hào)、PI3K-Akt信號(hào)、Toll樣受體信號(hào)和MAPK信號(hào)等通路發(fā)揮治療RA的作用。其中，TNF信號(hào)通路（hsa04668）的TNF-α通過(guò)結(jié)合受體TNFR1和TNFR2而激活，激活的TNF信號(hào)通路可導(dǎo)致NF-κB核異位和JNK、p38、AP-1活化，活化白細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞等，誘導(dǎo)多種炎必性因子和基質(zhì)酶的生成，導(dǎo)致滑膜炎癥反應(yīng)，引起關(guān)節(jié)破壞[33];PI3K-Akt信號(hào)通路（hsa04151）參與滑膜細(xì)胞的增殖與凋亡調(diào)節(jié)，在RA滑膜細(xì)胞中處于異常激活狀態(tài)[34];Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRS）信號(hào)通路（hsa04620）通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞因子的合成與釋放，促進(jìn)相關(guān)免疫分子的表達(dá)，活化免疫細(xì)胞，參與自身免疫性疾病過(guò)程[35]，其中TLR2和TLR4與RA的發(fā)病密切相關(guān)[36];絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路（hsa04010）亦屬于典型RA相關(guān)信號(hào)通路，其中的ERK1/2、JNK和p38 MAPK等信號(hào)分子的上調(diào)可促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖和分化，導(dǎo)致RA慢性滑膜炎[37]。此外，在直接相關(guān)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthrit）信號(hào)通路（hsa05323）上，“十二時(shí)辰”的作用靶點(diǎn)有Bcl-2（P10415）、IL-6（P05231）、ICAM-1（P05362）等RA相關(guān)因子，這再次提示Bcl-2在“十二時(shí)辰”潛在治療RA機(jī)制中的重要作用。

中醫(yī)藥抗RA的實(shí)驗(yàn)研究亦證實(shí)了上述信號(hào)通路在抗RA中的重要性。如桂枝芍藥知母湯可下調(diào)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠外周血TNF-α水平，誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡[38];青藤堿可抑制RA患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）中TLR4和TLR2表達(dá)，抑制DC成熟和細(xì)胞因子分泌，阻斷T細(xì)胞異?；罨?，從而發(fā)揮治療RA的作用[39]。這些結(jié)果與本次研究的結(jié)果相一致，提示“十二時(shí)辰”可能通過(guò)上述信號(hào)通路發(fā)揮治療RA的作用。

由此可見(jiàn)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析得知“十二時(shí)辰”的化學(xué)成分油酸、棕櫚酸、齊墩果酸、十五烷酸可能通過(guò)Bcl-2、COX-1、COX-2等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TNF、PI3K-Akt、Rheumatoid arthritis、Toll-like receptor和MAPK 等多條信號(hào)通路，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的異常增殖，減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療RA的作用。

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（收稿日期：2019-12-02 編輯：程鵬飛）

基金項(xiàng)目：福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810393028）。

作者簡(jiǎn)介：曾熙穎（1995-），女，漢族，本科在讀，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail：490294708@qq.com

通信作者：林凡（1976-），男，漢族，博士，副教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail：biolincn@qq.com