U0126納米藥物載體的制備及其用于肺動(dòng)脈高壓治療*

李 科，徐倉(cāng)寶，張亞萍，張 彥

(1.西安醫(yī)學(xué)院 陜西省缺血性心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種惡性進(jìn)展性疾病，愈后較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有1億的肺動(dòng)脈高壓患者，可發(fā)生于任何年齡，女性的患病率約為男性的2倍。盡管目前內(nèi)皮素(endothelin,ET)受體拮抗劑、磷酸二酯酶-5(phosphodiesterase-5,PDE-5)抑制劑、前列環(huán)素(prostacyclin 2,PGI2)及其類(lèi)似物等已用于PAH臨床治療，但PAH 患者的1a病死率仍高達(dá)15%， 在美國(guó)，原發(fā)性PAH患者的5a存活率低于35%[1-4]。肺血管過(guò)度收縮是PAH的一個(gè)重要特點(diǎn)，病理狀態(tài)下血管收縮因子內(nèi)皮素-1(endothlin-1，ET-1)的分泌量大大增多，會(huì)引發(fā)肺血管收縮異常[5]。而ET-1需通過(guò)內(nèi)皮素受體(endothlin receptor)發(fā)揮作用，其中的B型內(nèi)皮素受體(endothelintype B receptor，ETB)存在于血管平滑肌細(xì)胞中，介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞收縮和增殖，在正常狀態(tài)下僅有少量表達(dá)，對(duì)ETB受體激動(dòng)劑刺激無(wú)收縮反應(yīng)或僅有輕微的血管收縮。而在病理狀態(tài)下，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2(Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制被激活，使ETB受體表達(dá)增高，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞收縮增強(qiáng)，動(dòng)脈血管平滑肌呈現(xiàn)高反應(yīng)性，通過(guò)抑制該通路可以有效逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈血管病理收縮[6-7]。針對(duì)ERK1/2及相關(guān)通路的抑制劑有很多，其中有一部分被用于抗血管平滑肌收縮方面的研究，其中效果比較突出的是化合物PD98059[8]。徐倉(cāng)寶等后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)U0126具有更為顯著的抗血管收縮能力[9-10]。該化合物對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力比PD98059強(qiáng)100倍，且對(duì)其他眾多激酶的抑制作用非常弱[11]，是非常具有潛力的抗PAH治療分子。然而，U0126水溶性極差，且大劑量使用后會(huì)造成嚴(yán)重的臟器毒性，直接使用U0126存在一定局限性，所以需要通過(guò)新的手段和方式來(lái)推進(jìn)該化合物的應(yīng)用。

納米藥物載體為解決上述問(wèn)題帶來(lái)了新契機(jī)，已有很多納米藥物載體用于心血管治療的研究，國(guó)際上，Lanza團(tuán)隊(duì)在該領(lǐng)域研究相對(duì)較早，1998年發(fā)表了利用氟碳納米載體對(duì)心血管進(jìn)行治療的研究論文[12]。在中國(guó)，也有眾多學(xué)者利用各種納米藥物載體進(jìn)行心血管疾病治療的研究，其中包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、心律不齊及心肌缺血等多個(gè)方向[13-15]。因此納米載藥系統(tǒng)為U0126體內(nèi)干預(yù)PAH提供了強(qiáng)有力的支持。作者首先制備一種陽(yáng)離子兩親性淀粉，以其為包材構(gòu)建U0126納米載藥系統(tǒng)，依靠其小的粒徑、陽(yáng)離子表面完成組織和細(xì)胞的攝取，達(dá)到快速遞送和有效干預(yù)的作用，研究結(jié)果將為PAH的治療提供新方法及新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

可溶性淀粉：來(lái)源為玉米，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。

肉豆蔻酸(MA)、二甲基亞砜(DMSO)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTAC)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、香豆素-6：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；氫氧化鈉、冰醋酸、無(wú)水乙醇、乙醚：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司；CCK-8kit、Sarafotoxin 6c(S6c)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗-ETB抗體、抗β-actin抗體：Cell Signaling Technology Co.,Ltd；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、人胚肺成纖維細(xì)胞(IMR90)、小鼠脂肪細(xì)胞(3T3-L1)：來(lái)源均為美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)細(xì)胞庫(kù)；SD大鼠：雄性，250 g，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

核磁共振波譜儀：Advance 400MHz，德國(guó)Bruker公司；酶標(biāo)儀：ELx800，美國(guó)BioTek公司；馬爾文粒度儀：Nano-ZS90，英國(guó)Malvern公司；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)：H-600，日本Hitachi公司；高效液相色譜儀：LC-20A，日本Shimadzu公司；倒置熒光顯微鏡：Eclipse Ti-S，日本Nikon公司；微血管張力儀：630MA，丹麥DMT公司；電泳設(shè)備：164-5050，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 陽(yáng)離子雙親淀粉包材的合成及表征

將50 g可溶性淀粉105 ℃干燥2 h后倒入100 mL DMSO中，t=60 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min攪拌至溶解，依次加入4.56 g MA，3.8 g DCC和1.02 g DMAP，待全部溶解后密封瓶口，以室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h。反應(yīng)完畢后除去白色沉淀，利用V(乙醇)∶V(乙醚)=1∶1洗脫液收集沉淀，干燥后溶于20 mL純水中，再逐步加入1 mLc(NaOH)=1 mol/L溶液和5.2 mL GTAC，密封容器后，t=60 ℃,n=100 r/min，反應(yīng)4 h，使用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液至pH=7.0，利用乙醇/乙醚洗脫液獲取沉淀，并清洗3次，干燥后溶于30 mL純水中，裝入截留分子質(zhì)量為10 kDa的透析袋內(nèi)透析24 h，期間換水3次，冷凍干燥去除溶液中的水分獲得陽(yáng)離子雙親淀粉包材。

將制備的包材溶于d6-DMSO中，除雜后裝入核磁管內(nèi)，利用核磁共振波譜儀對(duì)樣品的核磁共振氫譜進(jìn)行分析。以可溶性淀粉、MA和GTAC為對(duì)照品。細(xì)胞毒性主要通過(guò)CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)，將HUVECs、IMR90和3T3-L1細(xì)胞按照8 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度種于96孔板上，在φ(CO2)=5%，t=37 ℃下培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的陽(yáng)離子雙親性包材，再繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)照孔細(xì)胞密度超過(guò)90%，向所有孔內(nèi)加入V(CCK-8)∶V(培養(yǎng)基)=1∶10的顯色培養(yǎng)液，孵育2 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)的吸光值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3 U0126納米藥物載體的構(gòu)建及表征

精確稱(chēng)取10 mg U0126和40 mg陽(yáng)離子雙親淀粉包材，混溶于5 mL DMSO中，超聲助溶后將混合DMSO溶液逐滴加入到12 mL水中，滴加過(guò)程中水溶液持續(xù)攪拌，n=1 500 r/min，滴加完成后繼續(xù)攪拌10 min即可獲得U0126納米藥物載體分散液。將制備的U0126納米藥物載體分散液通過(guò)截留分子質(zhì)量為10 kDa的透析袋透析24 h以去除溶劑和可溶性雜質(zhì)，期間換水3次。

利用馬爾文粒度儀對(duì)U0126納米藥物載體的粒徑及Zeta電勢(shì)進(jìn)行分析。將U0126納米藥物載體分散液滴在超薄碳膜銅網(wǎng)上，靜置15 min，吸去表面液體，待銅網(wǎng)干燥后，進(jìn)行TEM觀察。量取20 mL U0126納米藥物載體分散液，通過(guò)冷凍干燥除去水分，加入DMSO溶解殘?jiān)械腢0126，利用HPLC檢測(cè)濃度，計(jì)算包裹率及載藥量。

將2 mL U0126納米藥物載體分散液加入到4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，t=4 ℃，連續(xù)7 d檢測(cè)粒徑變化，以評(píng)估其在PBS中的穩(wěn)定性；將2 mL U0126納米藥物載體分散液加入到4 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中，t=4 ℃，連續(xù)7 d檢測(cè)粒徑變化，以評(píng)估其胎牛血清中的穩(wěn)定性；將2 mL U0126納米藥物載體分散液加入到4 mL胎牛血清中，t=37 ℃連續(xù)8 h檢測(cè)粒徑變化，以評(píng)估其在胎牛血清中的穩(wěn)定性。體外釋放實(shí)驗(yàn)首先取36 mL U0126納米藥物載體分散液，以每份3 mL的量分別裝入12個(gè)截留分子質(zhì)量為10 kDa的透析袋中進(jìn)行透析，t=37 ℃，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取一個(gè)透析袋，將袋內(nèi)的液體吸出，n=8 000 r/min，離心獲取沉淀，加入DMSO溶解沉淀中的U0126，利用HPLC檢測(cè)濃度，計(jì)算釋放量，最終繪制釋放曲線，以相同操作檢測(cè)U0126 DMSO溶液作為對(duì)照。

1.4 體外培養(yǎng)肺動(dòng)脈血管模型的構(gòu)建

將大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，在解剖鏡下小心取出肺動(dòng)脈，剝離周?chē)M織，利用V(Triton X-100)∶V(PBS)=1∶1 000內(nèi)皮洗脫液吹洗血管內(nèi)腔10 s以去除內(nèi)皮細(xì)胞。將血管組織置于含584 mg/LL-谷氨酰胺的DMEM低糖培養(yǎng)基中，在φ(CO2)=5%、t=37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h，獲得體外肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷模型。正常肺動(dòng)脈血管組織直接摘取新鮮血管即可。所得的各種血管組織根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求剪成相應(yīng)的長(zhǎng)度。

1.5 體外遞送及抗收縮效果檢測(cè)

利用熒光染料香豆素-6標(biāo)記納米藥物載體，用于遞送效果檢測(cè)。將去內(nèi)皮血管組織和正常肺動(dòng)脈血管組織模型分別灌入熒光標(biāo)記的納米藥物載體分散液，兩頭結(jié)扎后置于DMEM低糖培養(yǎng)基中，在φ(CO2)=5%、t=37 ℃環(huán)境下孵育4 h，用PBS清洗血管3次，用OCT膠包埋，t=-80 ℃冷凍24 h。利用冰凍切片機(jī)將血管組織切成厚度為5 μm的切片，利用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷納米藥物載體進(jìn)入組織的效果。

抗收縮效果所用的模型為內(nèi)皮損傷血管組織模型，將處理好的血管剪成長(zhǎng)度為2～3 mm的小段，分別置于培養(yǎng)基、含游離U0126的培養(yǎng)基和含U0126納米藥物載體的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，2個(gè)處理組中c(U0126)均為 10 μmol/L，孵育條件為φ(CO2)=5%，t=37 ℃，pH=7.4，孵育時(shí)間24 h，再取1組正常血管作為對(duì)照組。將所有組織固定在微血管張力儀上，平衡1.5 h，平衡張力為2 mN，再利用KCl刺激收縮，以判定血管組織可用性，之后加入c(S6c)=10-11～10-7mol/L的激動(dòng)劑來(lái)測(cè)定血管張力，并繪制收縮曲線。將與抗收縮實(shí)驗(yàn)中同樣處理的血管組織進(jìn)行研磨，提取總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，依次孵育抗ETB抗體和標(biāo)記二抗，進(jìn)行顯色，通過(guò)β-actin內(nèi)參比對(duì)，檢測(cè)ETB的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 陽(yáng)離子雙親淀粉包材的制備及表征

納米藥物載體的諸多功能都需要通過(guò)材料來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此包材的性能始終是最為重要環(huán)節(jié)之一。目前多種材料都被用于納米載體的制備。作為藥物載體材料，生物安全性始終是最為基本的要求。生物大分子具有良好的生物相容性和降解性，被廣泛用于納米材料的制備中。淀粉是世界上最豐富的多糖類(lèi)物質(zhì)之一[16]，除了作為食品外也被廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域，其中作為納米藥物載體材料的報(bào)道非常多[17-21]。但是直接使用淀粉也存在很大的問(wèn)題，首先該種物質(zhì)在體內(nèi)易于被降解，難以達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的效果；其次，由于淀粉是大分子物質(zhì)，分子量和結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致其很難直接構(gòu)建成較為均一的納米顆粒。所以，作者針對(duì)U0126的特性及后續(xù)給藥環(huán)境，基于淀粉設(shè)計(jì)合成了一種兼具陽(yáng)離子性和雙親性的納米包材。雙親性可以使包材在水環(huán)境中通過(guò)自組裝的方式直接包裹疏水性分子U0126，陽(yáng)離子性可以使其對(duì)抗體內(nèi)降解從而達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的效果。

通過(guò)核磁共振氫譜可以清晰看到陽(yáng)離子雙親淀粉材料的各個(gè)特征峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

δ圖1 陽(yáng)離子雙親淀粉材料的核磁共振氫譜結(jié)果

由圖1可知，其中2.51和3.43處的高峰為溶劑d6-DMSO和殘余水分的特征峰。a區(qū)域?yàn)槿舛罐⑺岬奶卣鞣澹謩e為脂肪鏈末端的甲基氫、脂肪鏈中部的亞甲基氫和緊鄰羰基的亞甲基氫；b處3.12為GTAC的特征峰；4.02～6為淀粉的特征峰。結(jié)果表明，肉豆蔻酸與淀粉成功接枝，實(shí)現(xiàn)淀粉的雙親性；GTAC成功地使包材陽(yáng)離子化，一方面使后續(xù)制備的納米載體具有正電性表面，另外使得其親水端具有更好的水合性。結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[22-23]。

為了保證材料的安全性，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)了所制備包材在3種細(xì)胞系上的細(xì)胞毒性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

ρ/(μg·mL-1)圖2 陽(yáng)離子雙親淀粉材料的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，陽(yáng)離子雙親淀粉對(duì)HUVECs、IMR90及3T3-L1細(xì)胞都沒(méi)有表現(xiàn)出很明顯的毒性，在所有設(shè)置的濃度下相對(duì)細(xì)胞存活率都超過(guò)90%，證明該材料具有很好的生物安全性。

2.2 U0126納米藥物載體的構(gòu)建

U0126是ERK1/2的高效抑制劑，但是其水溶性差導(dǎo)致生物利用度低，而高劑量使用又會(huì)造成其他臟器的毒性，因此作者通過(guò)納米載體技術(shù)來(lái)克服該藥物存在的不足。陽(yáng)離子雙親淀粉包材的設(shè)計(jì)和合成是基于U0126的結(jié)構(gòu)和作用環(huán)境完成的。U0126是一個(gè)疏水性化合物，其納米藥物載體制備主要通過(guò)包材與藥物通過(guò)疏水作用力進(jìn)行自組裝構(gòu)建。所構(gòu)建的U0126藥物載體屬于納米膠束， TEM觀察結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 U0126納米藥物載體的TEM觀察結(jié)果

由圖3可知，U0126納米藥物載體呈球狀，具有核殼結(jié)構(gòu)，均符合納米膠束的結(jié)構(gòu)特征。

動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得的粒徑分布結(jié)果見(jiàn)圖4。

D/nm圖4 U0126納米藥物載體的粒徑分布圖

由圖4可知，其平均粒徑為(113±6.9)nm，與TEM觀察結(jié)果相符。

對(duì)所制備的納米藥物載體表面電性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其表面電勢(shì)為(23.4±2.8)mV，具有明顯的正電性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

U/mV圖5 U0126納米藥物載體的Zeta電勢(shì)結(jié)果

由圖5可知，U0126納米藥物載體構(gòu)建成功。

2.3 U0126納米藥物載體的性能表征

利用HPLC測(cè)量并計(jì)算納米藥物載體中U0126濃度，納米藥物載體的包裹率為(93.8±2.8)%，載藥量為(17.4±4.6)%。表明U0126納米藥物載體包載性能良好，可將非水溶性化合物U0126有效分散在水溶液中，大大提高了其生物利用度。

穩(wěn)定性是納米載體應(yīng)用的基礎(chǔ)。作者通過(guò)將U0126納米藥物載體分散到不同液體環(huán)境中，并連續(xù)檢測(cè)其粒徑，通過(guò)粒徑變化評(píng)估其穩(wěn)定性。U0126納米藥物載體在PBS中7 d的粒徑變化趨勢(shì)見(jiàn)圖6。

由圖6可知，粒徑變化小于10%，穩(wěn)定性良好。

t/d圖6 U0126納米藥物載體在PBS中的穩(wěn)定性

U0126納米藥物載體后續(xù)的遞送和抗收縮實(shí)驗(yàn)需要在培養(yǎng)基中完成，檢測(cè)其在完全培養(yǎng)基內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖7。

t/d圖7 U0126納米藥物載體在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性

由圖7可知，7 d內(nèi)納米載體的粒徑變化很小，表現(xiàn)出非常好的穩(wěn)定性。然而從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中U0126納米藥物載體的粒徑比在PBS中略大，其原因可能是納米顆粒表面帶正電，吸附了培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)導(dǎo)致的。

U0126納米藥物載體的體內(nèi)最終作用環(huán)境應(yīng)該是血液中，因此為了保證其具有體內(nèi)可用性，將制備獲得的納米載體分散在血清中，進(jìn)一步進(jìn)行粒徑檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8。

t/h圖8 U0126納米藥物載體在血清中的穩(wěn)定性

由圖8可知，在生理環(huán)境下U0126納米藥物載體表現(xiàn)出了非常好的穩(wěn)定性，8 h內(nèi)粒徑變化非常小。此外，該實(shí)驗(yàn)中納米載體的粒徑進(jìn)一步增大，其原因同樣來(lái)自于表面吸附的蛋白質(zhì)，血清中的游離蛋白多于培養(yǎng)基中，故而其吸附層的厚度將會(huì)更大，該吸附層在體內(nèi)可以保持納米載體的穩(wěn)定性，另外還能防止其被清理，更加提高了所攜帶藥物的生物利用度。

通過(guò)透析法檢測(cè)U0126納米藥物載體的體外釋放性能，0～72 h共設(shè)置12個(gè)時(shí)間點(diǎn)。由于U0126為非水溶性，因此需要檢測(cè)透析袋內(nèi)沉淀中的U0126含量，并計(jì)算繪制釋放曲線，結(jié)果見(jiàn)圖9。

t/h圖9 U0126納米藥物載體體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖9可知，游離U0126在最初的1 h內(nèi)即沉淀了90%，4 h后即達(dá)到平衡，不存在穩(wěn)定釋放現(xiàn)象。相比之下，U0126納米藥物載體則可穩(wěn)步緩慢地釋放攜帶的藥物，直至72 h仍有60%的藥物包封于載體內(nèi)部。由此可知，納米藥物載體給U0126提供了一個(gè)穩(wěn)定的疏水內(nèi)核，使得整個(gè)釋放過(guò)程穩(wěn)定而持久，表明其在體內(nèi)使用過(guò)程中可以使血中的藥物一直維持在一個(gè)較高的水平，達(dá)到緩釋的效果。

2.4 U0126納米藥物載體的遞送性能

U0126納米藥物載體的遞送通過(guò)在血管組織內(nèi)的積累來(lái)進(jìn)行觀察。為此首先用具有綠色熒光的香豆素-6標(biāo)記了納米載體，然后建立體外肺動(dòng)脈血管培養(yǎng)模型，該模型進(jìn)行了內(nèi)皮消解，以模擬內(nèi)皮損傷狀態(tài)。將熒光標(biāo)記的納米藥物載體注入新鮮的正常血管和培養(yǎng)的模型血管內(nèi)部，共孵育后進(jìn)行冰凍切片，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 U0126納米藥物載體在正常血管內(nèi)的積累

由圖10可知，內(nèi)層內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，可以看到除了內(nèi)皮層以外，血管壁內(nèi)部熒光信號(hào)較低，部分區(qū)域只能看到彈力纖維的自發(fā)熒光。該結(jié)果說(shuō)明，納米藥物載體無(wú)法快速的穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血管壁組織深處。

內(nèi)皮損傷模型血管的成像結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 U0126納米藥物載體在模擬內(nèi)皮損傷血管內(nèi)的積累

由圖11可知，血管內(nèi)側(cè)熒光信號(hào)不連貫，表明內(nèi)皮層被破壞，部分區(qū)域?yàn)槿睋p狀態(tài)。血管壁內(nèi)平滑肌層的熒光信號(hào)顯著增高，熒光信號(hào)積累程度遠(yuǎn)高于正常血管組織，大部分區(qū)域都超過(guò)了彈力纖維的自發(fā)熒光。該結(jié)果表明，U0126納米藥物載體可有效進(jìn)入受損的血管壁，并在其內(nèi)部大量積累。

2.5 U0126納米藥物載體的抗收縮效果

通過(guò)微血管張力儀來(lái)檢測(cè)U0126納米藥物載體在體外肺動(dòng)脈血管培養(yǎng)模型上的抗收縮效果，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于血管收縮和舒張方面的研究[24-25]。U0126納米藥物載體、游離U0126與肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷模型共孵育后，通過(guò)微血管張力儀檢測(cè)其在不同濃度ETB受體激動(dòng)劑S6c作用下的收縮效果，并繪制出K+收縮率曲線，結(jié)果見(jiàn)圖12。

log c圖12 體外抗收縮效果

由圖12可知，未加任何干預(yù)的去內(nèi)皮血管收縮性最強(qiáng)，約為K+收縮效果的50%，U0126可明顯降低血管的收縮，其收縮效率約為K+的20%，而U0126納米藥物載體干預(yù)組的收縮率則更小，與游離U0126具有顯著性差異。該結(jié)果表明納米藥物載體可更為有效地使藥物進(jìn)入受損的血管平滑肌細(xì)胞層，進(jìn)而起到抑制收縮的效果。

正常血管平滑肌細(xì)胞的ETB受體均表達(dá)較少，而在病理狀態(tài)下，ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)合成新的ETB受體，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞收縮增強(qiáng)[6-7]。U0126通過(guò)抑制ERK1/2通路進(jìn)而逆轉(zhuǎn)ETB受體在平滑肌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，以起到治療效果。為進(jìn)一步證明抗收縮效果是源自U0126對(duì)ETB受體高表達(dá)的抑制，通過(guò)western blotting檢測(cè)了各組中ETB受體的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖13。

圖13 ETB受體蛋白在不同處理組織中的表達(dá)水平

由圖13可知，正常血管中ETB受體表達(dá)量非常少，而非處理組的肺動(dòng)脈血管損傷模型血管中ETB受體表達(dá)量顯著增高。而經(jīng)過(guò)游離U0126和U0126 納米藥物載體處理的血管中ETB受體表達(dá)量均有下降，值得注意的是U0126納米藥物載體組顯著低于游離U0126，該結(jié)果與前面收縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，充分證明了U0126納米藥物載體能更好抑制ETB受體表達(dá)，從而起到抗血管收縮的效果。

3 結(jié) 論

作者將納米藥物載體技術(shù)應(yīng)用于肺動(dòng)脈高壓治療研究中，并取得了有效的結(jié)果。通過(guò)對(duì)可溶性淀粉接枝肉豆蔻酸使其獲得雙親性，再利用GTAC對(duì)接枝淀粉進(jìn)行陽(yáng)離子化，最終獲得了一種安全低毒的陽(yáng)離子雙親淀粉包材，該包材通過(guò)疏水自組裝法可有效包封非水溶性化合物U0126，獲得的納米藥物載體具有良好的包載能力，可靠的穩(wěn)定性及緩釋功能，極大地提高U0126的生物利用度。在體外肺動(dòng)脈血管培養(yǎng)模型中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U0126納米藥物載體可顯著積累至損傷的動(dòng)脈血管壁內(nèi)部，而在正常血管中積累較少，能大大提高藥物的抗收縮效果，通過(guò)抗收縮機(jī)制的研究最終進(jìn)一步確定了該納米藥物載體是通過(guò)抑制ERK1/2通路來(lái)逆轉(zhuǎn)ETB受體過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗血管收縮效果，為開(kāi)發(fā)PAH治療的新方法提供了科學(xué)依據(jù)。