高分辨液質(zhì)聯(lián)用法測定奧司他韋原料藥中有關(guān)物質(zhì)*

陳志謙，符旭東，鐘昌平

（1. 湖北省武漢市漢陽醫(yī)院，湖北 武漢 430050； 2. 中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

奧司他韋磷酸鹽是一種用于治療流感的抗病毒藥物，可選擇性抑制病毒的神經(jīng)氨酸酶來控制病毒的復(fù)制，用于治療流感。與扎那米韋（zanamivir）相比，奧司他韋屬乙酸酯類藥物，在體內(nèi)肝酯酶作用下能迅速轉(zhuǎn)化為高活性的奧司他韋羧酸鹽，有利于生物體的快速吸收，可大大減少并發(fā)癥的發(fā)生（如氣管與支氣管炎、肺炎等）［1-2］，是目前治療禽流感最有效的藥物［3-4］。隨著禽流感在全球范圍的暴發(fā)，奧司他韋作為對H1N1，H5N1，H9N2 等亞病毒具有抑制作用的抗病毒藥物受到廣泛關(guān)注。由于流行病暴發(fā)及相應(yīng)市場需求的無法預(yù)測性，大量的奧司他韋會被存儲起來，以防備流行病的發(fā)生，超過5 年保存期導(dǎo)致大量過期，又因其存儲昂貴而未被銷毀。關(guān)于過期奧司他韋的藥物有效性及安全性，歐洲藥品管理局和美國食品藥物管理局（FDA）規(guī)定，在非特殊情況下，不得使用過期及未按要求儲存的奧司他韋。同時，學(xué)術(shù)界對過期奧司他韋的安全性及成分也開展了研究［5-6］。本研究中采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）法測定奧司他韋原料藥中的有關(guān)物質(zhì)，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，旨在為奧司他韋的質(zhì)量控制及安全使用提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters acquity 液相色譜儀，Xevo TQ-S 型質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源，飛行時間質(zhì)譜檢測器，Mass Lynx V4.1 數(shù)據(jù)分析軟件，均購自美國沃特世公司；Mettler AE-240 型電子天平（梅特勒公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

奧司他韋對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為101096-201501）；奧司他韋原料藥（藥企A，批號為180621-34）；甲酸為LCMS 級，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱為Kinetex 柱（100mm×2.1mm，2.6 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯 度 洗 脫（0～1 min 時2%B，7～9 min 時100%B，9.1～12 min 時2%B）；流速為0.4 mL / min；檢測波長為207 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源，正離子全掃描方式，MS1 掃描范圍為質(zhì)荷比（m/ z）100～1 000，MS2 掃描范圍為m / z 100～1 000；噴霧電壓為2.5 kV；錐孔電壓為25 V；去溶劑溫度為500 ℃；去溶劑氣體為800 L/h。

2.2 溶液制備

取奧司他韋對照品5 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的奧司他韋對照品溶液。取奧司他韋原料藥50 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的奧司他韋供試品貯備液；量取上述貯備液2 mL，置10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得奧司他韋供試品溶液。

2.3 奧司他韋含量測定

2.3.1 色譜分析

取2.2 項(xiàng)下各溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果奧司他韋相對保留時間（RT）為4.18 min，峰形良好。色譜圖見圖1。

圖1 奧司他韋高效液相色譜圖

2.3.2 奧司他韋裂解規(guī)律

在UPLC-Q-TOF-MS 系統(tǒng)中，將奧司他韋對照品溶液以流動注射方式進(jìn)樣（流速為0.1 mL/min），獲得一級（MS1）和二級（MS2）質(zhì)譜圖。奧司他韋分子式為C16H28N2O4，單同位素精確質(zhì)量為312.204 9。MS1 中m/ z 313.212 8 為［M+H］+（見圖2 A），與理論值m/ z 313.212 2 比較，誤差為-1.91×10-6，表明儀器精密度高，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

對奧司他韋二級質(zhì)譜圖進(jìn)行解析（見圖2 B），其裂解碎片規(guī)律主要根據(jù)準(zhǔn)確分子方程式，等效雙鍵數(shù)（DBE），奇偶數(shù)互變脫氮，由分子結(jié)構(gòu)特性等進(jìn)行推測，其主要碎片包括m/ z 226.107 7，208.097 1，166.086 3，138.054 4，120.044 4。

圖2 奧司他韋標(biāo)樣質(zhì)譜圖

奧司他韋的加氫離子［M+H］+的m/ z 為313.212 8，分子結(jié)構(gòu)式為C16H29N2O4+，DBE 為4.0。碎片離子m/ z 226.107 7 的精確離子結(jié)構(gòu)式為C11H16NO4+，DBE 為4.0。由于m / z 在碎裂前后由奇數(shù)變?yōu)榕紨?shù)，表明有N 的脫落，而DBE 沒有發(fā)生改變，且沒有O 的變化，表明脫落的N 為連接在環(huán)上的氨基。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，脫落的C5H13為醚上的碳支鏈。碎片離子m/ z 208.097 1，其精確離子結(jié)構(gòu)式為C11H14NO3+，DBE 為5.0，在碎片離子m/ z 226.107 7 的基礎(chǔ)下脫去1 個H2O，根據(jù)結(jié)構(gòu)及DBE 值增加1 分析，脫去位置為環(huán)上的酚羥基，并形成雙鍵。

奧司他韋有關(guān)物質(zhì)提取離子流圖見圖3。由碎片離子m/ z 208.097 1 可見，可發(fā)生多個途徑的分子碎裂：1）碎片離子 m/ z 166.086 3，其精確離子結(jié)構(gòu)式為C9H12NO2+，DBE 為4.0，在碎片離子m/ z 208.097 1 的基礎(chǔ)上脫去C2H2O，DBE 值減少1，因此減去了1 個含氧雙鍵，但這個含氧雙鍵不會是羧基上C=O，否則其后面的C2H5O 都會脫去，因此脫去的為連接在氨基上的羰基；2）碎片離子m/ z 138.054 4，其精確離子結(jié)構(gòu)式為C7H8NO2+，DBE 為4.0，在碎片離子m/ z 208.097 1 的基礎(chǔ)下脫去C2H2O+C2H4，因此除了脫去連接在氨基上的羰基還脫去了酯上的乙基；3）碎片離子m/ z 120.044 4，其精確離子結(jié)構(gòu)式為C7H6NO+，DBE 為4.0，在碎片離子m/ z 138.054 4 基礎(chǔ)上繼續(xù)脫去1 個H2O，只能發(fā)生在羧基上脫水。奧司他韋分子的裂解規(guī)律分析與文獻(xiàn)［7-9］報道一致，有助于分析奧司他韋降解規(guī)律，以及分解產(chǎn)物和雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定。

圖3 奧司他韋有關(guān)物質(zhì)提取離子流圖

2.4 奧司他韋有關(guān)物質(zhì)檢測及結(jié)構(gòu)鑒定

在奧司他韋原料藥中共鑒定出4 種有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)1，2，3，4），其保留時間分別為1.41，2.25，4.36，4.08 min，詳見圖3。雜質(zhì)3 和雜質(zhì)4 為2015 年版《中國藥典（二部）》磷酸奧司他韋收錄雜質(zhì)。雜質(zhì)1 和雜質(zhì)2 尚未見報道，可能為藥品合成工藝中的副產(chǎn)物，也可能是由于奧司他韋藥物長期儲存發(fā)生分解產(chǎn)生，其安全性未知。

雜質(zhì)1 出峰時間為1.41 min，其一級質(zhì)譜圖中m/ z 243.133 8 為［M+H］+（見圖4 A），分子式預(yù)測結(jié)果為C11H18N2O4，與理論值m/ z243.133 9 誤差為-0.59×10-6。按和奧司他韋裂解規(guī)律類似的方法推導(dǎo)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其可能的結(jié)構(gòu)見圖3。二級質(zhì)譜主要碎片為m/ z 208.096 4，166.085 7，137.070 1，120.043 8，109.075 6（見圖4 B），可能的二級裂解規(guī)律推導(dǎo)見圖5 A。

雜質(zhì)2 出峰時間為2.25 min，其一級質(zhì)譜圖中m/ z 243.133 6 為［M+H］+（見圖4 C）。分子式預(yù)測結(jié)果為C11H18N2O4，與理論值m/ z243.133 9 誤差為-1.40×10-6。由于雜質(zhì)2 的出峰時間在雜質(zhì)1 后，推測其可能的結(jié)構(gòu)見圖3。二級質(zhì)譜主要碎片為m/ z 166.085 7，162.052 6，137.070 1，120.043 8，109.075 6（詳見圖4 D），可能的二級裂解規(guī)律推導(dǎo)見圖5 B。

圖4 奧司他韋雜質(zhì)1 和雜質(zhì)2 的一級和二級質(zhì)譜圖

2.5 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：稱取奧司他韋原料藥50 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果主峰與以上破壞產(chǎn)生的降解物峰均能獲得良好分離，不干擾奧司他韋的測定。

圖5 奧司他韋雜質(zhì)1 和雜質(zhì)2 的二級碎片裂解推導(dǎo)圖

線性關(guān)系考察：取奧司他韋對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.25，0.5，1.0，5.0，12.5 μg/mL 的溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣20 μL，測定。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=24.15C+1.213，r=0.9996（n=5）。結(jié)果表明，奧司他韋質(zhì)量濃度在0.25～12.50 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限和檢測限：取奧司他韋對照品溶液，逐步稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。以信噪比（S/ N）=10 計(jì)，奧司他韋定量限為9 ng；以S/ N=3 計(jì)，檢測限為3 ng。

精密度試驗(yàn)：取奧司他韋對照品溶液，按擬訂色譜條件聲進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣5 次。結(jié)果的 RSD 為0.17%（ n=5），表明儀器精密度良好。

3 討論

采用UPLC-Q-TOF-MS 法對奧司他韋藥物的結(jié)構(gòu)及其分子在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律進(jìn)行精確地定性分析，其裂解碎片的質(zhì)量數(shù)與理論值間的偏差均在10-6量級，證明了方法的準(zhǔn)確性及結(jié)構(gòu)推導(dǎo)的可靠性。本研究中對奧司他韋碎片裂解的定性分析可以用于奧司他韋藥物的質(zhì)譜快速鑒定，以及食品、環(huán)境等各種基質(zhì)中的殘留檢測及藥物評價。

本研究中首次鑒定出奧司他韋原料藥中2 種新型有關(guān)物質(zhì)。有可能為藥品合成工藝中的副產(chǎn)物，也可能是由于奧司他韋藥物長期儲存發(fā)生分解產(chǎn)生，其服用后對生物體的影響未知，其藥用效果及毒理有待后續(xù)評價。