高效液相色譜法同時測定利肝隆片中5 種成分含量

呂情花，李永華

（湖南省婁底市食品藥品檢驗檢測所，湖南 婁底 417000）

利肝隆片由板藍根、茵陳、郁金、五味子、甘草、當歸、黃芪、刺五加浸膏等中藥組方，具有疏肝解郁、清熱解毒等功效，用于治療急、慢性肝炎，遷移性肝炎，慢性活動性肝炎，且對血清丙氨酸氨基轉移酶、麝香草酚濁度、黃疸指標降低作用顯著，對乙型肝炎表面抗原轉陰有較好效果［1］。原標準中僅有化學鑒別項，無含量測定方法。目前，關于該品種的標準研究也較少，但方中單味藥主要成分［如板藍根中的（R，S）-告依春［2-4］，茵陳中的綠原酸［5-7］，五味子中的五味子醇甲［8-10］，刺五加浸膏中的紫丁香苷［11］，甘草中的甘草酸銨［12-13］］的研究報道很多。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定（R，S）-告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨的含量，建立了質(zhì)量控制標準，可為全面地控制該制劑的質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）；XS205 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；TP-1200 型電子天平（湘儀天平儀器設備有限公司，精度為千分之一）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為350 W，頻率為35 kHz）。

1.2 試藥

（R，S）-告依春對照品（批號為111753-201706），綠原酸對照品（批號為110753-201817，含量為96.8%），五味子醇甲對照品（批號為110857-201714，含量為99.9%），紫丁香苷對照品（批號為111574-201605，含量為95.2% ），甘草酸銨對照品（批號為110731-201720，含量為97.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；水為Ⅰ級純化水；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；利肝隆片（承德天原藥業(yè)股份有限公司，批號分別為1703007，1712001；黑龍江未名天人制藥有限公司，批號為20181107；陜西制藥有限責任公司，批號為20170505）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry? C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～10min 時10%A，10～40min 時10%A→55%A，40～41min時55%A→10%A，41～50min 時10%A；流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：250 nm。

2.2 溶液制備

分別取（ R，S）告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL 含相應對照品106.2，388.4，224.4，164.9，202.7 μg 的溶液，即得各對照品貯備液；分別精密量取各對照品貯備液適量，置同一容量瓶中，加70%甲醇稀釋 成 每1 mL 含 相 應 對 照 品21.24，77.68，44.88，19.79，40.53 μg 的混合對照品溶液。取樣品20 片，除去包衣，研細，取細粉1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加70%甲醇25.00 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率為350 W，頻率為35 kHz）提取30 min，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按利肝隆片處方和制法分別制備缺板藍根、茵陳、五味子、刺五加浸膏、甘草的陰性樣品，并各取適量，按供試品溶液制備方法分別制備相應的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果，各檢測成分與相鄰成分能完全分離，陰性對照無干擾，理論板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液1，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得各被測成分回歸方程和線性范圍。詳見表1。

表1 5 種成分的線性關系考察結果（ n=5）

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣7 次，每次10 μL。結果（R，S）-告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為0.27%，0.48%，0.29%，0.35%，0.11%（n=7），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為1703007）樣品6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果（R，S）-告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨的平均含量分別為170.2，797.7，292.8，169.2，405.6 μg/g，RSD 分 別 為0.55% ，0.73% ，0.62%，0.98%，1.14%（n=6），表明方法重復性好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為1703007）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，6，12，18，24 h 時各進樣10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果（R，S）-告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為0.87%，0.68%，1.35%，0.91%，1.01%（n=5），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為1703007），精密加入（R，S）-告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨對照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取4 批樣品，依法平行制備2 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定（R，S）-告依春、綠原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸銨的含量。結果見表3。

表3 4 批樣品含量測定結果（μg/g，n=2）

3 討論

3.1 流動相選擇

曾比較甲醇-0.02%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05% 磷酸溶液，結果表明，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相梯度洗脫時，各色譜峰的分離度、峰形、基線最好。另外，比較了初始比例，乙腈-0.05%磷酸溶液（15 ∶85，V/ V）和乙腈-0.05%磷酸溶液（10 ∶90，V/ V），結果（R，S）-告依春、紫丁香苷色譜峰保留時間基本一致，最終選擇乙腈-0.05%磷酸溶液（10 ∶90，V/ V）。

3.2 提取條件選擇

曾考察不同提取時間（15，30，40 min）和不同體積分數(shù)提取溶劑（50%，60%，70%，80%，100%甲醇）對樣品中各成分溶出量的影響，結果五味子醇甲、紫丁香苷、綠原酸超聲提取30 min，在不同體積分數(shù)提取溶劑中溶出量基本一致，但（R，S）-告依春、甘草酸銨用70%甲醇提取溶出量最大，故選擇用70%甲醇超聲處理30 min。3.3 檢測波長選擇

曾采用DAD 檢測器在線采集了5 個成分在200～400 nm 波長范圍內(nèi)的吸收光譜圖，結果顯示，（R，S）-告依春、綠原酸、紫丁香苷、五味子醇甲、甘草酸銨分別在245，327，265，250，250 nm 波長處有最大吸收，通過分析三維圖譜，考慮待測成分的最大吸收及其他成分干擾，最終選擇250 nm 為檢測波長，（R，S）-告依春、綠原酸、紫丁香苷在250 nm 波長處雖無最大吸收，但也較強，可進行有效檢測，且該波長下基線平穩(wěn)。另外還比較了（R，S）-告依春（245 nm）、綠原酸（327 nm）、紫丁香苷（265 nm）各最大吸收波長處與250 nm 波長處的測定值，結果相差不到5%?？梢姡?50 nm 波長處各成分的干擾小。故選擇250 nm 為檢測波長。