3 種醫(yī)院外用制劑微生物限度檢查方法的建立*

鄧 莉，陳勇川，胡 斌，馬 攀，胡 婧

（中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038）

醫(yī)院制劑主要是針對(duì)本院臨床需要且需求量小、不適合工廠批量生產(chǎn)的品種，控制其質(zhì)量是保證臨床安全用藥的前提。對(duì)藥品的微生物進(jìn)行控制是控制藥品質(zhì)量的一項(xiàng)重要檢查項(xiàng)目［1］，也是保障制劑安全性的重要組成部分。尿素軟膏、維生素E 乳膏、復(fù)方苯甲酸軟膏均為我院院內(nèi)制劑，療效確切，臨床應(yīng)用廣泛。為控制其質(zhì)量，保證檢測(cè)方法的可靠性和準(zhǔn)確性，確保其微生物限度達(dá)到要求［2］，本研究中參考文獻(xiàn)［3-8］，按2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105，1106，1107 項(xiàng)下要求［9］，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，建立了3 種外用制劑微生物限度的檢查方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Scientific-1381 A2 型生物安全柜（美國(guó)Thermo 公司）；TB124S 型分析天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為百分之一）；LRH-150F 型生化培養(yǎng)箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器公司）；MJ-180-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；LDZF-30KB-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 材料

試藥：復(fù)方苯甲酸軟膏（批號(hào)為180226，規(guī)格為每盒18 g），維生素E 乳膏（批號(hào)為180130，規(guī)格為每支50 g），尿素軟膏（批號(hào)為180108，規(guī)格為每盒18 g），均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為1703022），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1706262），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1702134），甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為170104），溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為170103），均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

菌種：銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 菌液制備

按2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105 項(xiàng)下方法制備菌液。

2.1.2 供試液制備

尿素軟膏供試液：取尿素軟膏10 g，加入含無(wú)菌十四烷酸異丙酯20 mL 和無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，振搖，混勻，再加入pH 7.0 的45 ℃無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，混勻，靜置，待油水明顯分層，取水層，作為1 ∶10 的供試液。

維生素E 乳膏供試液［10］：取維生素E 乳膏10 g，加入pH 7.0 的45 ℃無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，混勻，作為1 ∶10 的供試液。取20 mL 1 ∶10 的供試液，加入pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，搖勻，制成1 ∶50 的供試液。

復(fù)方苯甲酸軟膏供試液：方法一，取復(fù)方苯甲酸軟膏10 g，加入含20 mL 無(wú)菌十四烷酸異丙酯和無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，振搖，混勻，加入pH 7.0 的45 ℃無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，混勻，靜置，待油水分層，取水層，作為1 ∶10 的供試液；取1 ∶10 的供試液10 mL，加入pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，搖勻，制成1 ∶100 的供試液。方法二，取復(fù)方苯甲酸軟膏10 g，加入含無(wú)菌十四烷酸異丙酯20 mL 和無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，充分振搖，混勻，加入11 mL 的1 mol/L 無(wú)菌氫氧化鈉溶液，再加45 ℃的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液89 mL，振搖，混勻，靜置，待油水分層明顯，取水層，作為1 ∶10 的供試液；進(jìn)一步稀釋為1 ∶100 的供試液。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組［11-12］：取2.1.2 項(xiàng)下尿素軟膏1 ∶10 供試液、維生素E 乳膏1 ∶10 供試液和1 ∶50 供試液各9.9 mL，2.1.2 項(xiàng)下復(fù)方苯甲酸軟膏方法一中1 ∶100供試液和方法二中1 ∶100 供試液9.9 mL，各5 份，每份分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉菌菌懸液各0.1 mL，使供試液每1 mL 含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL，注入平皿，每份平行制備2 個(gè)平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定需氧菌總數(shù)。取2.1.2 項(xiàng)下尿素軟膏、維生素E 乳膏1 ∶10 供試液9.9 mL，復(fù)方苯甲酸軟膏方法一中1 ∶100 供試液和方法二中1 ∶100 供試液9.9 mL，各2 份，分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌懸液各0.1 mL，使供試液每1 mL 含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL 注入平皿，平行制備2 個(gè)平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置25 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定霉菌及酵母菌總數(shù)。

菌液對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。

供試品組：用稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

稀釋劑組：用稀釋液代替供試液、菌液，同試驗(yàn)組操作。

回收率：試驗(yàn)組菌比值=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品組的平均菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組的平均菌落數(shù)。霉菌和酵母菌總數(shù)見(jiàn)表1，需氧菌總數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

驗(yàn)證結(jié)果：按2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105 微生物計(jì)數(shù)法進(jìn)行驗(yàn)證，做3 次平行試驗(yàn)。需氧菌總數(shù)檢查，尿素軟膏采用常規(guī)法，維生素E 乳膏采用培養(yǎng)基稀釋法，復(fù)方苯甲酸軟膏采用中和法和培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)用，5 種試驗(yàn)菌回收率比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi)；霉菌及酵母菌總數(shù)檢查，尿素軟膏、維生素E 乳膏采用常規(guī)法、復(fù)方苯甲酸軟膏可用中和法和培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)用，2 種試驗(yàn)菌回收率比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi)。結(jié)果均符合藥典規(guī)定。

表1 霉菌和酵母菌回收率比值

表2 需氧菌總數(shù)回收率比值

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 金黃色葡萄球菌

試驗(yàn)組：取2.1.2 項(xiàng)下1 ∶10 尿素軟膏、維生素E乳膏供試液各10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的金黃色葡萄球菌，同時(shí)分別接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻；取2.1.2 項(xiàng)下復(fù)方苯甲酸軟膏方法二中1 ∶10 供試液10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的金黃色葡萄球菌，同時(shí)接種至200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。菌液對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。供試品組：用稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

稀釋劑組：用稀釋液代替供試液、菌液，同試驗(yàn)組操作。驗(yàn)證結(jié)果：結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 銅綠假單胞菌

試驗(yàn)組：取2.1.2 項(xiàng)下1 ∶10 尿素軟膏、維生素E乳膏供試液各10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液，同時(shí)分別接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻；取2.1.2 項(xiàng)下復(fù)方苯甲酸軟膏方法二中1 ∶10 供試液10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液，同時(shí)接種至200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

菌液對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。

供試品組：用稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

稀釋劑組：用稀釋液代替供試液、菌液，同試驗(yàn)組操作。

驗(yàn)證結(jié)果：結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，控制菌檢查中，尿素軟膏、維生素E 乳膏采用常規(guī)法，試驗(yàn)組相應(yīng)陽(yáng)性菌能正常檢出。復(fù)方苯甲酸軟膏采用中和法加稀釋法，試驗(yàn)組相應(yīng)陽(yáng)性菌均能正常檢出。

3 討論

不同醫(yī)院配制的制劑，即使名稱相同，由于采用的工藝和輔料等不同，制劑仍可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性，故微生物限度檢查方法不能簡(jiǎn)單復(fù)制［13］，需經(jīng)各單位針對(duì)各制劑進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。在對(duì)醫(yī)院制劑的方法驗(yàn)證活動(dòng)中應(yīng)遵從“就簡(jiǎn)不就繁”，盡量按常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法，或考慮培養(yǎng)基稀釋法與中和法聯(lián)用，最后采取薄膜過(guò)濾法的順序進(jìn)行。

本研究結(jié)果顯示，尿素軟膏的微生物限度檢查方法為需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查、控制菌檢查，均可采用常規(guī)法；維生素E 乳膏的微生物限度檢查方法為需氧菌總數(shù)檢查，可采用稀釋法（1 ∶50），霉菌和酵母菌總數(shù)檢查可采用常規(guī)法，控制菌檢查均可采用常規(guī)法；復(fù)方苯甲酸軟膏的微生物限度檢查方法為需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查，可采用中和法加稀釋法（2.1.2 項(xiàng)下復(fù)方苯甲酸軟膏方法二1 ∶100），控制菌檢查均可采用中和法加稀釋法，取2.1.2 項(xiàng)下復(fù)方苯甲酸軟膏方法二1 ∶10 供試液加入不少于200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

在建立這3 個(gè)制劑的方法驗(yàn)證時(shí)，開(kāi)始都采用無(wú)菌十四烷酸異丙酯萃取，結(jié)果軟膏較理想，油相和水相分層較清晰。而乳膏萃取時(shí)不能很好地分散，經(jīng)比較，最終確定的樣品分散方法為：樣品10 g，加恒溫45 ℃的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL。

3 個(gè)制劑中，尿素軟膏具有抗菌、止癢等作用，在驗(yàn)證中采用常規(guī)法，回收率比值為0.5～2.0，方法準(zhǔn)確、可靠；維生素E 為維生素類藥物，其并無(wú)抑菌作用，由于配方中加入了布羅波爾防腐劑，用常規(guī)法無(wú)法消除其抑菌性，采用1 ∶50 的稀釋法能使回收率比值為0.5～2.0，消除了其抑菌成分；在對(duì)復(fù)方苯甲酸軟膏的驗(yàn)證時(shí)，最初采用了1 ∶10 和1 ∶100 的稀釋法，5 種菌株均未見(jiàn)生長(zhǎng)。苯甲酸、水楊酸均有抗細(xì)菌、真菌作用。苯甲酸在酸性環(huán)境中抑菌作用強(qiáng)，在堿性環(huán)境下作用減弱，兩者配伍應(yīng)用可增強(qiáng)抗菌作用［14］。測(cè)得1 ∶10 供試液pH為3.5，后考慮酸堿中和法，改變?nèi)芤簆H 來(lái)排除苯甲酸和水楊酸對(duì)微生物限度檢查結(jié)果的干擾。經(jīng)試驗(yàn)得出中和劑的量為11 mL 的1 mol /L 無(wú)菌氫氧化鈉溶液，可調(diào)節(jié)1 ∶10 供試液的pH 至6～8，同時(shí)采用測(cè)試菌株對(duì)中和劑進(jìn)行了回收試驗(yàn)，回收率比值均為0.5～2.0。表明此中和劑和中和產(chǎn)物的有效性及對(duì)微生物的無(wú)毒性可滿足試驗(yàn)的要求，可消除該制劑中抑菌成分的干擾，可確保方法的科學(xué)性和檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。