抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠Smad3 及其相關(guān)miRNAs 的影響

楊 曦，熊 劍，魏云杰

（湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 十堰 442000）

擴張型心肌病（DCM）指以心室心腔擴大和收縮功能障礙為特征的復合型心肌病，會引起心力衰竭（簡稱心衰）、心律失常和猝死［1］。該病的發(fā)病群體以50 歲以上中年人居多，起病緩慢，早期診出率較低［1］，且病因不明，致死率較高，無特效治療手段，預后極差［2］。中醫(yī)根據(jù)DCM 的癥狀及病理特點，將其歸于“心衰病”“水腫”“心水”等范疇，病機在于心之陽氣不足，無力推動血行，瘀血積聚，或水飲不化，痰濕停留，繼而使心體脹大［3］，因此益氣、活血、利水為治療該病的基本原則。西醫(yī)常規(guī)治療以對癥治療、控制心律失常和心衰、糾正心室重構(gòu)為主，但其遠期療效有限；中醫(yī)可明顯緩解其臨床癥狀，毒副作用較西藥少，在改善心肌異常、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，降低病死率，提高生活質(zhì)量，改善預后方面均有明顯優(yōu)勢［3-4］。抗纖益心方具有益氣升陷、活血化瘀功效，能改善臨床癥狀，減小左室舒張末內(nèi)徑、左房內(nèi)徑，改善心功能［5-6］。王振濤等［7］的研究結(jié)果顯示，抗纖益心方可下調(diào)DCM 模型大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）和上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-1 抑制劑（TIMP-1）蛋白水平，減輕心肌組織纖維化，抑制心室重構(gòu)。張會超等［8］也觀察到抗纖益心方對DCM 大鼠心肌纖維化有一定的抑制作用，并能改善心功能，其作用機制與轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/Smads 信號系統(tǒng)密切相關(guān)。微小RNA（miRNAs 或miRs）是一系列長約22 nt 的非編碼RNA，能通過海綿作用吸附其靶向mRNA，調(diào)控了有機體超過70%的基因活動，是近幾年病理機制研究的熱點，為諸多疾病的臨床診治提供了新靶點和新方向。心肌纖維化增生導致的心室重構(gòu)是擴張型心肌病發(fā)生與發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［9］。本研究中選取Smad3，對可能調(diào)控其mRNA表達的miR-23-3p 和miR-145-5p 進行了分析，觀察了抗纖益心方對各指標的影響，以及各指標間的關(guān)系，探討抗纖益心方治療DCM 的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：ABI 7500 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）；Nanodrop 分光光度計（天根生化科技＜北京＞有限公司）；Mini-PROTEAN? Tetra 小垂直板電泳槽（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；Trans-Blot 小型轉(zhuǎn)印槽（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 圖像處理分析系統(tǒng)（美國Media Cybemetics 公司）；1-14k型臺式高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Vevo 770TM型小動物彩色多普勒超聲儀［加拿大VisualSonics Inc.公司，電壓為（220±22）V，頻率為（50±1）Hz，主機采集頻率≥1 000 Hz，大鼠實驗探頭頻率為15～22 MHz］。

試藥：抗纖益心方為干浸膏，由黨參、黃芪、云苓、白術(shù)、丹參、川芎、紅花、赤芍、澤蘭和益母草組方，由醫(yī)院制劑室提供，每1 g 浸膏相當于生藥4 g；呋喃唑酮片（山西云鵬制藥有限公司，批號為I-14023937）；卡托普利片（常州制藥廠有限公司，批號為I-B2023731）；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥＜集團＞上海化學試劑公司，批號為F20021216）；Smad3 多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗（中國Abcam 官網(wǎng)，批號分別為GR160516-2，GR160311-1）；miR-23-3p、miR-145-5p 擴增引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司，批號分別為20160211，20160218）；實時熒光定量PCR 試劑盒（上海羅氏公司，批號為75117）；TGF-β、MMP-1 及TIMP-1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（生工生物工程＜上海＞股份有限公司，批號分別為D730443，D730566，D730582）。

動物：健康清潔級Wistar 大鼠90 只，雌雄各半，6～8 月齡，體質(zhì)量（220±20）g，購自山東魯抗動物中心［合格證號為SCXK（魯）2016-0003］。所有大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由進食進水，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學院動物倫理委員會審批，動物飼養(yǎng)、干預及處死等操作均遵循有關(guān)實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.2 試驗方法

動物分組與模型制備：所有大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后稱定體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量進行隨機區(qū)組化分組，分為對照組（A 組）、模型組（B 組）、卡托普利組（C 組）、抗纖益心方低劑量組（D 組）、抗纖益心方中劑量組（E 組）和抗纖益心方高劑量組（F 組），各15 只。A 組正常飼養(yǎng)；其余5 組均參照文獻［10］的方法制備DCM 大鼠模型，將存活大鼠行超聲心動圖檢查，與A 組大鼠比較，左心室腔擴大，室壁變薄，左心室射血分數(shù)低于40%為造模成功［7］。造模成功后予以藥物干預，根據(jù)LD50實驗［11］確定動物的有效給藥劑量，以此設(shè)置抗纖益心方高、中、低3個劑量。C 組大鼠每日灌胃卡托普利10.125 mg/kg；D組、E 組、F 組大鼠每日分別灌胃抗纖益心方4.7，9.4，18.8 mg/kg；A 組與B 組大鼠予等量無菌蒸餾水灌胃刺激。共灌胃8 周，給藥期間，B 組有2 只大鼠死亡，D 組有1 只死亡，其余大鼠均進行后續(xù)實驗，并納入最終的試驗結(jié)果中，最終A 組、B 組、C 組、D 組、E 組和F 組的大鼠樣本量分別為15，13，15，14，15，15 只。

超聲心動圖測定心功能：各組大鼠最后1 次給藥24 h 后，給予50 mg/kg 1%戊巴比妥鈉麻醉，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能指標：左室收縮末壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）及左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

蛋白質(zhì)印跡（WB）法檢測心肌Smad3 蛋白表達：將大鼠麻醉后，先開腹，取腹腔主動脈血2 mL，用于熒光定量PCR 試驗，再開胸腔取心臟，吸干水分，并稱定質(zhì)量。從心尖位置沿冠狀面切取心肌組織2 份，-80 ℃存儲。取待測心肌100 mg，置2 mL 離心管中，剪碎，加入400 μL 裂解液（RIPA ∶PMSF=100 ∶1），電動勻漿器勻漿，充分裂解后離心，12 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP 管中，-20 ℃存儲，當天使用。首先，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，應用buffer 緩沖液配置質(zhì)量濃度為1.0 μg/μL 的混懸液，以備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用5 %濃縮膠和10 %分離膠進行蛋白電泳；上樣前先將蛋白質(zhì)樣本煮沸10 min 使其變性，上樣時調(diào)整上樣量，保證一致；先80 V 電泳30 min，再120 V 至電泳完成；80 V 恒壓轉(zhuǎn)膜1 h；室溫條件用5%脫脂奶粉封閉2 h；加入用Tween-20 Tris 鹽酸稀釋的Smad3 多克隆抗體（1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 液清洗3 次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1 ∶1 000）室溫孵育2 h，TBST 液清洗3 次，每次10 min；ECL 顯色液A 液和B 液混合均勻1 min 后，將膜蛋白面與ECL 底物充分接觸1 min，放入X 光片夾中；置暗室中曝光、顯影、定影。顯影后掃描蛋白質(zhì)印跡顯影圖，用ImageJ圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目標蛋白質(zhì)條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值（Smad3/β-actin）代表目標蛋白質(zhì)的相對表達量。

雙熒光素酶試驗測定Smad3 和miRNAs 間的靶向性：試驗細胞為大鼠心肌成纖維細胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種至96 孔板，設(shè)為pmir-GLO 組、Smad3-WT組、Smad3-MUT 組，每組6 個復孔。分別將pmir-GLO質(zhì)粒、Smad3-WT 質(zhì)粒和Smad3-MUT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至相應的細胞，培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。將轉(zhuǎn)染后的細胞進一步分為2 個亞組，分別采用miRNA mimics（miR-145-5p，miR-129-3p，miR-23-3p）及其對照NC mimics 干預，加入相應miRNA mimics 和NC mimics，更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。按雙熒光素酶報告試劑盒說明書要求裂解細胞，配置發(fā)光液，先將20 μL 樣品置入測量管，再加入100 μL發(fā)光液，輕輕敲擊管壁，使其混勻。記錄螢火蟲熒光素酶的相對熒光活性。

實時熒光定量PCR 法檢測miR-23-3p 及miR-145-5p 的表達水平：采用Trizol 法提取全血總RNA，用nanodrop 分光光度計檢測RNA 的純度和濃度，質(zhì)量合格的樣本置-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。采用Prime-ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 進行RNA 反轉(zhuǎn)錄，嚴格按試劑盒步驟操作。反轉(zhuǎn)錄完成后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肎oTaq? qPCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 型實時熒光定量PCR 擴增儀檢測miR-23-3p和miR-145-5p 的表達水平。反應體系：GoTaq? qPCR Master Mix 25 μL，upstream primer 1.0 μL，downstream primer 1.0 μL，模板cDNA 1.0 μL。反應條件：95 ℃1 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共擴增40 個循環(huán)；溶解曲線95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃1 s。每個樣本做3 個重復，最終的Ct 值取3 個重復的平均值。選擇U6 作為內(nèi)參基因，miR-23-3p 和miR-145-5p 的相對表達量以公式n=2-ΔΔCt來計算。

ELISA 法檢測TGF-β、MMP-1 及TIMP-1 蛋白水平：取適量心肌組織，剪碎，勻漿，嚴格按TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 ELISA 試劑盒的操作說明檢測心肌組織研漿液的TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件分析。數(shù)據(jù)均為連續(xù)性變量，采用± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析；如有統(tǒng)計學差異則采用LSD- t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心功能指標

與A 組相比，B 組大鼠的LVESP 和±dP/dtmax明顯下降，LVEDP 明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與B 組相比，C 組、D 組、E 組、F 組大鼠的LVESP 和±dP/dtmax顯著升高，LVEDP 顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與D 組相比，E 組和F 組大鼠的LVESP和±dP/dtmax顯著升高，LVEDP 顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（ ± s）

表1 各組大鼠心功能指標比較（ ± s）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，△P ＜0.05；與D 組相比，#P ＜0.05。

組別A 組（n=15）B 組（n=13）C 組（n=15）D 組（n=14）E 組（n=15）F 組（n=15）LVESP 135.2±11.3 75.9±10.1*116.9±10.4△97.4±9.6△129.2±9.3△#130.8±8.9△#LVEDP 5.6±1.3 10.9±1.8*6.5±1.4△8.3±1.9△5.2±1.7△#5.4±1.5△#+dp/dtmax 3 897±699 3 021±330*3 469±219△3 199±411△3 701±503△#3 821±415△#-dp/dtmax 3 753±272 3 029±243*3 489±236△3 099±254△3 600±259△#3 697±356△#

2.2 對DCM 大鼠Smad3 表達水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠的心肌Smad3 蛋白表達明顯升高；與B 組相比，C 組、D 組、E 組、F 組大鼠的心肌Smad3 蛋白表達水平顯著降低；與D 組相比，E 組和F 組大鼠的心肌Smad3 蛋白表達水平降低，且F 組低于E 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 各組擴張型心肌病大鼠Smad3 表達水平

2.3 Smad3 相關(guān)miRNAs 的驗證

生物信息學分析結(jié)果顯示，在與Smad3 基因存在結(jié)合位點的鼠源miRNAs 中，miR-145-5p，miR-129-3p，miR-23-3p 有較高的研究價值。采用雙熒光素酶報告試驗檢測了以上3 種miRNAs 與Smad3的結(jié)合能力。結(jié)果見圖2?？梢姡琺iR-145-5p 與Smad3，miR-129-3p 與Smad3 均有較高的靶向結(jié)合能力。

圖2 Smad3 基因相關(guān)的miRNAs 生物信息學及雙熒光素酶分析結(jié)果

2.4 對DCM 大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠的循環(huán)miR-23-3p 和miR-145-5p 表達水平明顯降低（P＜0.05）；與B 組相比，C 組、D 組、E 組、F 組大鼠的循環(huán)miR-23-3p和miR-145-5p 表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與D 組相比，E 組和F 組大鼠的循環(huán)miR-23-3p 和miR-145-5p 表達升高，且F 組高于E 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 6 組擴張型心肌病大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平比較（ ± s）

表2 6 組擴張型心肌病大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平比較（ ± s）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，△P ＜0.05；與D組相比，#P ＜0.05；與E 組比較，□P ＜0.05。下表同。

組別A 組（n=15）B 組（n=13）C 組（n=15）D 組（n=14）E 組（n=15）F 組（n=15）miR-23-3p 4.235 ±0.161 2.789 ±0.187*4.089 ±0.192△3.358 ±0.137△4.007 ±0.155△#4.169 ±0.163△#□miR-145-5p 4.282 ±0.104 2.309 ±0.175*4.197 ±0.140△3.324 ±0.131△4.173 ±0.128△#4.201 ±0.143△#□

2.5 心肌組織Smad3 表達與循環(huán)miR-23-3p 和miR-145-5p 水平的相關(guān)性

Pearson 檢驗結(jié)果顯示，大鼠心肌組織Smad3 表達與循環(huán)miR-145-5p 水平呈負相關(guān)性（R=-0.848，P＜0.05）；與循環(huán)miR-23-3p 水平也呈負相關(guān)性（R=-0.813，P＜0.05），其相關(guān)直線見圖3。

圖3 心肌組織Smad3 表達與循環(huán)miR-145-5p，miR-23-3p水平的相關(guān)直線

2.6 對DCM 大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠的TGF-β 和MMP-1 表達水平明顯升高（P＜0.05），TIMP-1 的表達水平明顯降低；與B 組相比，C 組、E 組、E 組、F 組大鼠的TGF-β和MMP-1 表達水平明顯降低，TIMP-1 表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與D 組相比，E 組和F 組大鼠的TGF-β 和MMP-1 水平降低，且F 組低于E 組；E 組和F 組大鼠的TIMP-1 水平升高，且F 組高于E 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 6 組擴張型心肌病大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平比較（ ± s）

表3 6 組擴張型心肌病大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平比較（ ± s）

組別A 組（n=15）B 組（n=13）C 組（n=15）D 組（n=14）E 組（n=15）F 組（n=15）TGF-β（μg/g）46.2±3.7 68.3±7.9*49.2±5.4△59.5±6.5△52.3±5.8△#47.2±5.2△#□MMP-1（ng/g）244.2±32.1 455.2±41.3*293.8±35.1△370.2±40.4△300.1±27.4△#275.6±21.7△#□TIMP-1（ng/g）696.2±75.2 463.7±55.5*655.3±58.3△477.8±51.9△544.7±60.8△#602.8±60.6△#□

3 討論

中醫(yī)認為，DCM 多因先天不足，或因后天失養(yǎng)，導致心氣虛，調(diào)治不當，發(fā)展為心陽虛、心之氣陰兩虛，形成瘀血、痰濕、水飲等病理產(chǎn)物，病位在心，與肺、肝、脾、腎密切相關(guān)［3，12］。王曉景等［13］的研究結(jié)果顯示，DCM 為本虛標實、虛實夾雜之癥，本虛以陽虛、氣虛為主，標實以血瘀、水停為主。DCM 心氣虛是基礎(chǔ)，心氣虧虛，鼓動無力，血脈不暢必致血瘀，血瘀是中心環(huán)節(jié)，氣虛血瘀存在于病變發(fā)展過程中的各個環(huán)節(jié)，故采用抗纖益心方治療該病療效可靠［5-8］。

心室重構(gòu)是擴張型心肌病發(fā)生與發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，心肌組織纖維化增生是參與心室重構(gòu)的關(guān)鍵［14］?？估w益心方對改善DCM 的臨床癥狀和心室形態(tài)有積極作用，但其藥理機制尚不明確。TGF-β1信號是參與纖維化增生的主要信號之一，在各種原因?qū)е碌男氖抑貥?gòu)中均介導重要機制［15］。Smads 家族蛋白是將TGF-β1信號從胞膜和胞質(zhì)傳遞至胞核的重要轉(zhuǎn)運蛋白，TGF-β 的直接作用底物，為TGF-β 信號通路中的關(guān)鍵傳導分子［16］。目前，已知的Smads 家族蛋白主要為Smad1～Smad9，其中參與TGF-β1信號轉(zhuǎn)導的主要為Smad2 和Smad3，由于Smad3 是介導心肌纖維化增生和心室重構(gòu)的關(guān)鍵物質(zhì)，故選擇Smad3［17］。TGF-β1/Smad3 信號通路在多種原因?qū)е碌男氖抑貥?gòu)中起介導作用，體外細胞學試驗證實，其作用機制可能與誘導纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，增強膠原蛋白的分泌等有關(guān)［18］。機體在正常狀態(tài)下，對心室重構(gòu)起決定作用的心肌細胞外基質(zhì)處于產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡，MMPs 是體內(nèi)參與心肌細胞外基質(zhì)降解的最主要酶系，TIMP-1 是MMP-1 的特異性抑制劑，故兩者間的平衡對維持心臟正常的代謝具有重要意義［19］。TGF-β 是一種心肌細胞外基質(zhì)的有效調(diào)節(jié)因子，能促進膠原的合成，并調(diào)節(jié)多種編碼MMP 的基因表達。研究顯示，抗纖益心方能抑制DCM 大鼠TGF-β1的表達，這可能是抗纖益心方干預DCM 大鼠動物模型心室重構(gòu)的機制之一［8，20］。本研究結(jié)果顯示，抗纖益心方DCM 大鼠心肌組織中Smad3 的表達有抑制作用，也就抑制了TGF-β / Smad3 信號通路的激活，減輕心肌組織的纖維化，因此對于改善其心肌功能有明顯效果。

本研究中在分析Smad3 與miRNAs 相關(guān)性前，首先采用生物信息學分析和雙熒光素酶試驗驗證了Smad3與各個miRNAs 的結(jié)合能力，從中篩選了miR-23-3p和miR-145-5p 這2 項指標。SUN 等［21］的研究已證實，miRNAs 主要通過與靶向mRNA 的非編碼區(qū)、開放閱讀框、啟動子或RNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，從而導致靶向mRNA 降解或翻譯抑制。有研究顯示，miR-23-3p 和miR-145-5p 對Smad3 的表達有負調(diào)控作用，當miR-23-3p 和miR-145-5p 的表達水平較高時，Smad3 的表達水平降低［22］。本研究結(jié)果顯示，DCM 大鼠的Smad3 表達水平升高，miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平降低，其變化趨勢相反，Pearson 檢驗也證實Smad3 和miR-23-3p、Smad3 和miR-145-5p 間呈負相關(guān)，從臨床角度證實了在DCM 中各個指標存在相互作用。ELISA 結(jié)果顯示，抗纖益心方能明顯改善DCM大鼠的TGF-β，MMP-1，TIMP-1 蛋白表達水平，尤其是高劑量抗纖益心方基本與西藥卡托普利的藥效相當。本研究結(jié)果顯示，應用抗纖益心方后，大鼠的循環(huán)miR-23-3p，miR-145-5p，TIMP-1 水平升高，心肌組織Smad3 和TGF-β，MMP-1 表達水平降低；另外，各指標的變化趨勢受抗纖益心方劑量的影響，呈劑量依賴性，其最佳劑量尚有待驗證。

綜上所述，抗纖益心方可上調(diào)DCM 大鼠的miR-23-3p 和miR-145-5p 的表達，下調(diào)Smad3 的表達，進而影響TGF-β/Smad3 通路，從而改善DCM 大鼠的心功能，其最佳有效劑量和用藥時間還有待進一步研究。