CRISPR/Cas9技術(shù)在園藝作物中的研究進(jìn)展

黃少勇 ,王 娟 ,王柏柯 ,李 寧 ,唐亞萍 ,楊生保 ,楊 濤 ,張國(guó)儒 ,帕提古麗·艾斯木托拉 ,高 杰,余慶輝

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】盡管園藝作物產(chǎn)量在不斷增加，但是品種的多樣性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值卻在下降[1]。由于長(zhǎng)期的馴化育種導(dǎo)致園藝作物遺傳多樣性變得狹窄以及野生近緣種的基因交流受到抑制而導(dǎo)致生殖隔離。獲得具有多樣性和理想特性的遺傳資源是園藝作物品種改良的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)育種在很大程度上依賴于現(xiàn)有的自然等位基因變異,或通過(guò)化學(xué)誘變劑或輻射來(lái)產(chǎn)生突變體[2]，作物改良過(guò)程費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，重組DNA技術(shù)允許將所需基因轉(zhuǎn)移到園藝作物中，為作物提供新的基因型和表型，從而提高產(chǎn)量，提升作物品質(zhì)，增強(qiáng)逆境適應(yīng)能力，延長(zhǎng)貨架期等。其中CRISPR/Cas9技術(shù)，可以快速有效地改善重要的農(nóng)藝性狀，如生物和非生物脅迫的響應(yīng)能力以及作物果實(shí)品質(zhì)等。一方面隨著越來(lái)越多植物基因組測(cè)序完成，為園藝作物的基因定位、結(jié)構(gòu)與功能分析研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為園藝作物改良提供重要參考信息。另一方面，不同園藝作物之間的巨大差異使得CRISPR/Cas9技術(shù)需要不斷地進(jìn)行改良。園藝作物之間、甚至植物與動(dòng)物之間的CRISPR/Cas9技術(shù)也可以相互借鑒與改進(jìn)。【前人研究進(jìn)展】CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中的研究多集中在模式植物如擬南芥、水稻、煙草和番茄等，而在園藝作物中，如紅薯[3]、蘑菇[4]、蘋(píng)果[5]、柑橘[6]和馬鈴薯[7]等也有不少的研究報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于CRISPR/Cas9技術(shù)在園藝作物中的研究報(bào)道逐年增多，技術(shù)本身也在不斷改進(jìn)?；仡櫧陙?lái)基因編輯技術(shù)在園藝作物中的研究進(jìn)展?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】總結(jié)近年來(lái)園藝作物中CRISPR/Cas9技術(shù)的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì),為園藝作物品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，收集與園藝作物相關(guān)的CRISPR/Cas9前沿技術(shù)研究報(bào)道。

1.2 方 法

整理匯總，并分析園藝作物的CRISPR/cas9技術(shù)研究進(jìn)展。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)理

2.1.1 CRISPR的發(fā)現(xiàn)與分類

1987年，荷蘭科學(xué)家首次在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)，用于防御噬菌體和外源質(zhì)粒的入侵[8]。2005年，3個(gè)不同的研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，許多CRISPR間隔子的短序列與來(lái)源于染色體外DNA的序列高度同源，表明CRISPR與特異性免疫之間存在一定的關(guān)系[9-11]。

一個(gè)完整的CRISPR/Cas系統(tǒng)由3部分組成：CRISPR序列、富含AT堿基的先導(dǎo)序列和可編碼cas蛋白的cas基因操縱子[12]。通常根據(jù)Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為3種主要類型：I型和III型系統(tǒng)使用的是大型多核蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行靶向與結(jié)合，而II型系統(tǒng)只需要1種蛋白質(zhì)，即Cas9 (CRISPR-associated protein 9)，該蛋白質(zhì)用于RNA引導(dǎo)的雙鏈DNA的識(shí)別和斷裂，形成RuvC和HNH 2個(gè)不同的區(qū)域[13]。Cpf1是第2類V型CRISPR系統(tǒng)中的另1種核酸內(nèi)切酶，在植物基因組編輯中也同樣有效[14]。由于作用機(jī)制的不同，每一種用于基因組編輯的核酸內(nèi)切酶都具有獨(dú)特的特性。

2.1.2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理

一般來(lái)說(shuō)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)外來(lái)DNA的作用可分為3個(gè)階段：一是獲得階段，識(shí)別入侵的DNA，并將從靶DNA衍生的間隔序列插入宿主CRISPR序列用于建立免疫記憶；二是表達(dá)階段，Cas9蛋白被表達(dá)，CRISPR序列被轉(zhuǎn)錄成前體RNA轉(zhuǎn)錄本(pre-crRNA)。隨后1個(gè)非編碼反式激活的CRISPR RNA (crRNA)與pre-crRNA和Cas9蛋白結(jié)合，將它們加工成成熟的RNA，即crRNAs；3是干擾階段，成熟的crRNAs引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別合適的DNA靶點(diǎn)，然后切割并降解入侵的外源DNA[15]。

Cas9蛋白切割DNA產(chǎn)生1個(gè)DSB (double-strand break site, 雙鏈斷裂位點(diǎn))，從而觸發(fā)細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制。在缺乏同源修復(fù)模板的情況下，易錯(cuò)的NHEJ (non-homologous end joining, 非同源末端連接)途徑被激活，并在DSB位點(diǎn)引入隨機(jī)的插入，刪除甚至替換，這種方式通常會(huì)導(dǎo)致基因功能的缺失。另外，如果獲得與DSB位點(diǎn)周圍序列同源的供體DNA模板，則會(huì)激活精確的HDR (homology-directed repair, 同源重組修復(fù))途徑，執(zhí)行精準(zhǔn)的基因修飾突變，包括基因敲入、刪除或突變[16]。目前，最常用的Cas9蛋白來(lái)自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes, Sp)。利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯，需要合成單鏈向?qū)NAs (single-guide RNAs, sgRNAs)來(lái)構(gòu)建CRISPR/cas9表達(dá)盒。然后，通過(guò)識(shí)別NGG的PAM(protospacer adjacent motif, 前間區(qū)序列鄰近基序)的sgRNAs引導(dǎo)Cas9蛋白到特定的基因組位點(diǎn)，并匹配目標(biāo)DNA序列[17]。

自2013年成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯植物基因組以來(lái)，已經(jīng)將其轉(zhuǎn)化為更強(qiáng)大的工具。目前，CRISPR/Cas9具有多基因編輯功能，即1次編輯多個(gè)基因[18]。此外，CRISPR/Cas9不僅可以靶向1個(gè)編碼基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)[19]和非編碼區(qū)[20]，還可以靶向包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA (ncRNA)、microRNA[21]及啟動(dòng)子區(qū)[22]。還可以在不需要DSB的情況下，在基因組靶點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)單堿基替換[23]。

2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在園藝作物中的應(yīng)用

2014年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次在番茄中應(yīng)用，研究人員將Argonaute7基因敲除后使番茄葉片產(chǎn)生Wiry表型[24]。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，在越來(lái)越多的園藝作物中得到應(yīng)用，包括草莓[25]、香蕉[26]、葡萄[27]、蘋(píng)果[28]、西瓜[29]和獼猴桃[30]。該文總結(jié)了CRISPR/Cas9在番茄等園藝作物上的研究應(yīng)用，主要包括：影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高果實(shí)品質(zhì)、響應(yīng)生物與非生物脅迫，以及作物馴化等。表1

表1 CRISPR/Cas9在番茄等園藝作物上的應(yīng)用

2.2.1 影響植物生長(zhǎng)發(fā)育

草莓作為1種模式生物，常被用于特定基因的功能分析。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除草莓ARF8 (auxin response factor 8, 生長(zhǎng)素響應(yīng)因子8)，證實(shí)arf8純合突變體比野生型植株幼苗生長(zhǎng)快[25]。據(jù)報(bào)道，番茄TM6基因(tomato MADS-box gene 6)在雄蕊發(fā)育過(guò)程中起主要作用[31]。為了證明其在草莓中的功能，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建1個(gè)八倍體的tm6突變體進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)其花藥存在嚴(yán)重缺陷，表明TM6在草莓花發(fā)育中同樣起著重要作用[32]。此外，利用CRISPR/Cas9策略研究YUCCA10 (YUC10)基因在草莓果實(shí)發(fā)育的生長(zhǎng)素合成過(guò)程中的生物學(xué)作用。當(dāng)敲除YUC10時(shí)，在yuc10突變體中觀察到游離生長(zhǎng)素顯著減少[33]。除了草莓的功能性研究外，越來(lái)越多的研究人員正致力于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯研究，以期改良其它園藝作物。

成功構(gòu)建了靶向TCS (tea caffeine synthase, 咖啡堿合成酶)的CRISPR/Cas9基因編輯載體，為茶樹(shù)其他基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建，提供了借鑒方法[34]。研究發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)AZF2 (Arabidopsis zinc-finger protein 2, 擬南芥鋅指蛋白2)基因可能參與了根的發(fā)育。利用CRISPR/Cas9方法將新疆楊PalAZF2定點(diǎn)敲除，構(gòu)建palazf2新疆楊突變體植株。研究發(fā)現(xiàn)，敲除PalAZF2的突變體植株的生根速度減慢，推測(cè)PalAZF2基因與根的生長(zhǎng)有關(guān)，參與調(diào)控新疆楊的生長(zhǎng)發(fā)育[35]。CRISPR/Cas9技術(shù)在重要農(nóng)藝性狀改良方面同樣具有巨大的優(yōu)勢(shì)。以甘藍(lán)BoPDS(Phytoene desaturase, 八氫番茄紅素脫氫酶)為靶基因，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)基因組的精準(zhǔn)編輯。在轉(zhuǎn)基因T0代植株中觀察到白化的葉片表型，37.5%的轉(zhuǎn)基因植株在BoPDS基因預(yù)期位置上發(fā)生核苷酸缺失突變。在BoPDS的同源基因Bol016089中也檢測(cè)到在相應(yīng)位置上發(fā)生突變。研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可作為有效改良甘藍(lán)品種的基因編輯工具[36]。

2.2.2 提高果實(shí)品質(zhì)

果實(shí)品質(zhì)既包括果實(shí)大小，顏色和貨架期等外在品質(zhì)，也包括口感風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等內(nèi)在品質(zhì)。在番茄果實(shí)中，花心皮產(chǎn)生的子房室數(shù)對(duì)番茄果實(shí)大小影響最大[37]。經(jīng)典的CLAVATA-WUSCHEL(CLV-WUS)干細(xì)胞通路可以調(diào)控番茄的心室數(shù)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)番茄SlCLV3啟動(dòng)子突變，獲得的轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株具有較多的心室和較大的果實(shí)[38]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別以PSY1 (phytoene synthase 1，八氫番茄紅素合成酶1)、MYB12 (MYB transcription factor 12, MYB轉(zhuǎn)錄因子12)和ANT2 (Anthocyanin 2, 花色苷2)為靶位點(diǎn)，成功地培育出黃色[39]、粉紅色[40]和紫色[41]番茄。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)可以使RIN(ripening inhibitor)[42]或者DML2 (DNA demethylase 2)[43]失活，延緩果實(shí)的成熟時(shí)間，從而延長(zhǎng)貨架期。有研究報(bào)道，在不降低番茄口感和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的情況下，通過(guò)沉默PL (pectate lyase, 果膠裂解酶)[44]和ALC (alcobaca)[45]成功地控制果實(shí)的軟化，這表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)將是園藝作物果實(shí)品種改良的一個(gè)重要工具。

已有報(bào)道利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)調(diào)節(jié)其代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)來(lái)提高果實(shí)中花青素(Anthocyanin)[46]、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)[47]和番茄紅素(lycopene)[48]的含量。此外，研究人員還利用CRISPR/Cas9鑒定到番茄中蘋(píng)果酸(malate)含量的關(guān)鍵調(diào)控基因ALMT9 (aluminum-activated malate transporter 9, 鋁激活蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)[49]。

2.2.3 響應(yīng)生物與非生物脅迫

園藝作物通常面臨各種生物與非生物的脅迫，隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是CRISPR/Cas系統(tǒng)的建立，為植物抵御各種脅迫提供了新方法[50,51]。通過(guò)定位外殼蛋白和基因組的復(fù)制酶位點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)抗番茄黃葉卷曲病毒進(jìn)行了基因工程設(shè)計(jì)。發(fā)現(xiàn)編輯的番茄植株比野生型番茄表現(xiàn)出高效的病毒抗性，積累的病毒基因組DNA較少，且這種免疫活性可以世代傳遞[52]。通常，植物RNA病毒需要宿主因子以維持其生命周期，如eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建突變體破壞eIF4E的功能，對(duì)黃瓜葉脈黃變病毒、西葫蘆黃花葉病毒和番木瓜環(huán)斑花葉病毒均具有免疫功能[53]。此外，敲除番茄DCL2 (Dicer-like 2)基因，獲得的dcl2突變體在感染馬鈴薯X病毒(potatovirusX,PVX)、煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)和番茄花葉病毒(tomatomosaicvirus,ToMV)時(shí)表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀，說(shuō)明DCL2參與了對(duì)RNA病毒的防御[54]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)使內(nèi)源性香蕉條紋病毒(endogenousbananastreakvirus,eBSV)失活，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)編輯的對(duì)照組相比，75%的被編輯植株無(wú)癥狀表現(xiàn)[55]。

在擬南芥中，DMR6 (downy mildew resistant)屬于2-氧戊二酸鐵(II)依賴氧合酶超家族成員，參與水楊酸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，過(guò)表達(dá)AtDMR6后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)霜霉病的敏感性增強(qiáng)[56]。而利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)番茄DMR6同源基因突變，發(fā)現(xiàn)dmr6突變體對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、辣椒疫霉、黃單胞菌在內(nèi)的多種病原菌均表現(xiàn)出了抗病性，且該突變對(duì)植株無(wú)危害[57]。Mlo1 (Mildew resistant locus O 1)編碼一種膜相關(guān)蛋白，對(duì)引起白粉病的真菌具有敏感性。利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得mlo1功能缺失的番茄突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體對(duì)白粉病真菌(Oidiumneolycopersici)具有完全抗性[58]。值得注意的是，通過(guò)自交轉(zhuǎn)化株T0將轉(zhuǎn)移DNA (T-DNA)分離，并在子代中鑒定到無(wú)T-DNA插入的mlo1突變體，這些突變體被認(rèn)為是無(wú)轉(zhuǎn)基因作物。MLO7 (mildew resistance locus O 7)和WRKY52 (WRKY transcription factor 52)分別與白粉菌(Erysiphenecator)和灰霉病菌(B.cinereal)抗性相關(guān)。Malnoy等[59]和Wang等[60]分別在蘋(píng)果和葡萄中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得的功能缺失突變體對(duì)白粉菌和灰霉病菌免疫性增強(qiáng)。番茄果實(shí)極易感染灰霉病，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除掉MAPK3 (Mitogen-activated protein kinase 3)后，間接增強(qiáng)SlJAZ1和SlMYC2的表達(dá)，從而證明MAPK3在番茄抗灰霉病中起著積極的作用[61]。柑橘潰瘍病是由柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas citri)引起的，通過(guò)CRISPR/Cas9編輯柑橘LOB1 (lateral organ boundaries 1)的啟動(dòng)子區(qū)域獲得抗柑橘潰瘍病的突變植株對(duì)柑橘潰瘍病表現(xiàn)出高度的抗性[62]。

通常BZR1 (Brassinazole resistant 1)調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)反應(yīng)，參與BR介導(dǎo)的發(fā)育過(guò)程。研究人員在番茄中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-bzr1突變體，證實(shí)BZR1還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜受體蛋白激酶FERONIA (FER)基因參與番茄的耐熱性[63]。同時(shí)，番茄也是1種對(duì)低溫敏感的作物，其果實(shí)品質(zhì)容易受低溫脅迫影響。研究發(fā)現(xiàn)CBF1 (C-repeat binding factor 1)保護(hù)植物免受凍害，通過(guò)CRISPR/Cas9獲得的cbf1突變體表現(xiàn)出比野生型植株更嚴(yán)重的凍害癥狀[64]。此外，MAPK3不僅具有番茄灰霉病抗性，還能通過(guò)保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷的方式參與番茄的干旱脅迫響應(yīng)[65]。

2.2.4 作物的馴化

從野生植物演變?yōu)樵耘嘧魑锏倪^(guò)程叫做植物馴化。傳統(tǒng)的園藝作物馴化方式是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工選擇獲得理想表型。而CRISPR/Cas9則可以加快引種馴化的過(guò)程。作物產(chǎn)量很大程度上取決于花的數(shù)量，而花序結(jié)構(gòu)決定花的數(shù)量。在番茄中，多花花序的形成依賴于轉(zhuǎn)錄因子TMF(TERMINATING FLOWER)的精確調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)TMF蛋白和3個(gè)番茄BOP (blade-on-petiole)同源基因相互作用，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。利用CRISPR/Cas9分別構(gòu)建CR-slbop1/3、CR-slbop1/2、CR-slbop2/3等雙突變體和CRISPR-bop1/2/3三突變體，這些缺失突變體花序都極其簡(jiǎn)化。證明SlBOP與其同源基因功能相似，影響花序結(jié)構(gòu)，特別是CRISPR-bop1/2/3三突變體的開(kāi)花速度比野生型快，但具有極其簡(jiǎn)化的花序[66]。單性結(jié)實(shí)是園藝作物理想的農(nóng)藝性狀，利用CRISPR/Cas9敲除番茄的AGL6 (AGAMOUS-LIKE 6)基因獲得突變體為單性結(jié)實(shí)表型，由于該突變不會(huì)對(duì)果實(shí)的重量和外形有影響，沒(méi)有引起同源基因的變化，因此，AGL6是單性結(jié)實(shí)的一個(gè)理想基因[67]。赤霉素或生長(zhǎng)素信號(hào)的升高可誘導(dǎo)植物的單性結(jié)實(shí)，由參與生長(zhǎng)素信號(hào)通路的IAA9 (indole-3-acetic acid inducible 9)和ARF7 (auxin response factor 7)基因敲除產(chǎn)生的突變體均為單性結(jié)實(shí)[68]。此外，番茄果實(shí)的果柄無(wú)分離層更便于機(jī)械化采收，育種家們利用CRISPR/Cas9技術(shù)培育出番茄MBP21 (MADS-box protein 21)功能缺失的突變體mbp21為無(wú)果節(jié)表型[69]。過(guò)去要通過(guò)漫長(zhǎng)的人工馴化工作才能獲得這些理想的園藝作物表型，現(xiàn)在通過(guò)CRISPR/Cas9體系可以更快捷，高效的將其引入園藝作物中。

通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)還可以將理想的農(nóng)藝性狀引入野生植物中，從頭馴化野生種是另1種有效的園藝作物馴化策略。利用多重CRISPR/Cas9技術(shù)編輯編碼序列、順式調(diào)控區(qū)或上游開(kāi)放閱讀框，將與形態(tài)、花果產(chǎn)量和抗壞血酸合成相關(guān)的理想性狀引入4個(gè)耐脅迫野生番茄材料中。不含Cas9基因的編輯植株后代具有馴化的表型，但仍保持了親本的抗病性和耐鹽性[70]。姑娘果是1種生長(zhǎng)在中美洲和南美洲的野生茄科植物，利用CRISPR/Cas9，分別將3種控制株型、花量和果實(shí)大小的番茄同源序列(SP, SP5G和CLV1)引入姑娘果中，從而改善了姑娘果的主要農(nóng)藝性狀[71]。應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過(guò)引入遠(yuǎn)緣模式植物的已知農(nóng)藝性狀來(lái)加速各種野生植物的馴化過(guò)程成為了可能。

3 討 論

3.1 盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)本身還存在編輯效率低、脫靶風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)，在各種園藝作物中建立高效的CRISPR/Cas9體系還存在許多局限和挑戰(zhàn)，但是隨著研究人員對(duì)CRISPR/Cas9體系不斷研究發(fā)現(xiàn)，影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率的主要因素包括2個(gè)重要元件(Cas9和sgRNA)。因此，對(duì)Cas9蛋白的改造以及提高sgRNA的特異性是提高編輯效率，降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)的有效途徑。

3.2 對(duì)Cas9進(jìn)行改造，使其中1個(gè)結(jié)構(gòu)域失活，得到突變型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶。Cas9蛋白經(jīng)過(guò)這一改造，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用時(shí)就需要設(shè)計(jì)2條sgRNA，該策略可使脫靶效應(yīng)降至1/1 000[72]?？蒲腥藛T對(duì)Cas9稍加改動(dòng)，使其迅速擴(kuò)增，積累突變，再識(shí)別PAM序列并對(duì)臨近DNA進(jìn)行切割，最終獲得CRISPR/Cas9不僅提高了編輯效率，同時(shí)還降低了脫靶風(fēng)險(xiǎn)[73]。將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9的2個(gè)保守的內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，使Cas9蛋白失去內(nèi)切核酸酶活性，稱之為dead Cas9 (dCas9)。dCas9不能切割DNA但仍能與sgRNA形成復(fù)合物并與特定DNA序列結(jié)合。該系統(tǒng)不會(huì)造成DNA雙鏈斷裂，可避免在特定基因上的永久突變對(duì)宿主的影響。尤其是在調(diào)控基因表達(dá)中的作用，既可用于激活特定基因的表達(dá)(CRISPR activation, CRISPRa)，也可用于抑制特定基因轉(zhuǎn)錄(CRISPR interference, CRISPRi)?？捎糜趯?shí)現(xiàn)對(duì)園藝作物表觀基因組更好的控制[74]。

3.3 在提高sgRNAs特異性方面，成功構(gòu)建了1種基于靶向差異sgRNAs的代理報(bào)告系統(tǒng)(Discriminated sgRNAs based SurroGate system, DisSUGs)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)或腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor, ABE)編輯后細(xì)胞的高效富集。經(jīng)DisSUGs系統(tǒng)篩選后，平均75%的再生植株都實(shí)現(xiàn)了堿基編輯，比常規(guī)編輯方法提高了3～5倍，其中ABE的效率平均可以達(dá)到81%左右[75]。近期報(bào)道，在大豆中通過(guò)篩選高效sgRNA，提升編輯效率的策略。設(shè)計(jì)了70個(gè)sgRNA靶向102個(gè)大豆基因，通過(guò)16次轉(zhuǎn)化得到407個(gè)T0株系，覆蓋所有sgRNA，多數(shù)sgRNA有3個(gè)以上獨(dú)立株系，整體基因編輯效率為59.2%，其中35.6%為多基因突變[76]。隨著CRISPR/Cas9體系的不斷成熟完善，越來(lái)越多園藝作物CRISPR/Cas9系統(tǒng)的成功構(gòu)建，該技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用范圍將越來(lái)越廣。

4 結(jié) 論

回顧近年來(lái)運(yùn)用CRISPR技術(shù)在園藝作物的生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)、響應(yīng)各類脅迫和作物馴化等方面的主要成就，尤其是利用CRISPR技術(shù)編輯的作物原生質(zhì)體中無(wú)外源DNA傳遞，可以快速高效地獲得理想表型的園藝作物新品種，加快具有優(yōu)良表型的園藝作物培育生產(chǎn)。園藝作物種類繁多，但是其中大部分園藝作物的遺傳信息仍然缺乏。隨著全基因組與泛基因組等測(cè)序工作的不斷完成，越來(lái)越多的園藝作物遺傳信息得以闡明?；谥匾r(nóng)藝性狀(如抗逆、抗病、花期、育性和高度等)基因定位信息不斷完善，以及對(duì)決定園藝作物性狀的主要基因的挖掘，構(gòu)建不同園藝作物的CRISPR/Cas9體系，將加快園藝作物在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生產(chǎn)上的發(fā)展。