響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶制備干酪素工藝

蔡麗莎，王東鵬，曾 珍，李 誠

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000）

凝乳酶干酪素是以新鮮牛乳或“曲拉”為原料，用酶使酪蛋白凝結(jié)沉淀，經(jīng)洗滌、脫水、干燥、粉碎而成白色或微黃色產(chǎn)品[1]，具有高營養(yǎng)、低脂肪、低膽固醇等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、皮革、造紙、紡織、醫(yī)藥、包裝等行業(yè)[2]。國內(nèi)大部分生產(chǎn)凝乳酶干酪素企業(yè)均以“曲拉”為原料，但品質(zhì)較差，近年來更多企業(yè)轉(zhuǎn)向以鮮奶為原料生產(chǎn)干酪素[3]。

干酪素生產(chǎn)凝乳酶包括動(dòng)物源凝乳酶、植物源凝乳酶和微生物源凝乳酶等。最常用凝乳酶為小牛皺胃酶，以小牛皺胃酶凝乳制備干酪素，顆粒細(xì)膩雪白，乳香持久，乳化性、起泡性等特性優(yōu)異，但小牛皺胃酶來源有限、價(jià)格高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)需求。

Moschopoulou等研究發(fā)現(xiàn)小牛皺胃酶主要由凝乳酶（EC3.4.23.4）、胃蛋白酶A和胃亞蛋白酶組成，是復(fù)合酶，為制備高品質(zhì)干酪素原因之一[4]。楊勤等使用胃蛋白酶制備干酪素，產(chǎn)品功能性質(zhì)與小牛皺胃酶制品差異不顯著，制備成本降低，但產(chǎn)品顏色偏黃[5]。Luo等從白首烏干葉中提取粗蛋白酶并研究其凝乳活性，發(fā)現(xiàn)其在凝乳過程中有過度水解及產(chǎn)生苦味小肽缺陷[6]。黃夢瑤等發(fā)現(xiàn)凝乳酶具有極高蛋白水解能力，在凝乳時(shí)破壞生成干酪素，產(chǎn)品純度下降[7]。本研究采用新鮮牛乳為原料，選取胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成復(fù)合凝乳酶，采用混料設(shè)計(jì)、單因素設(shè)計(jì)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究復(fù)合酶制備干酪素最佳生產(chǎn)工藝條件，分析酪素紅外光譜特性等理化性質(zhì)，比較復(fù)合酶制備干酪素與小牛皺胃酶制備干酪素產(chǎn)品性質(zhì)差異，以期為復(fù)合凝乳酶干酪素制備研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳，購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場；小牛皺胃酶（酶活≥100 000 U·g-1），購自濰坊悅祥化工有限公司；胃蛋白酶（酶活≥30 000 U·g-1）、風(fēng)味蛋白酶（酶活≥40 000 U·g-1）、中性蛋白酶（酶活≥50 000 U·g-1），均購自上海瑞永生物科技有限公司；溴化鋇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸等試劑均為分析純，購自四川雅安萬科公司。

1.2 儀器設(shè)備

pH3C+型pH計(jì)，購自成都世紀(jì)方舟科技有限公司；X3R冷凍離心機(jī)，購自美國Thermo公司；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海一恒科技有限公司；FW-100高速粉碎機(jī)，購自北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜儀，購自美國PerkinElmer公司；SC-80C型全自動(dòng)色差計(jì)，購自北京康光儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小牛皺胃酶制備干酪素工藝

小牛皺胃酶制備干酪素工藝參見文獻(xiàn)[8]方法。

1.3.2 復(fù)合酶制備干酪素制備工藝

1.3.2.1 制備工藝流程

新鮮牛奶→離心脫脂→巴氏殺菌→冷卻→加酶凝乳→切割與滅活→過濾洗滌→干燥→粉碎→成品。

1.3.2.2 操作要點(diǎn)

離心脫脂：新鮮牛乳于4℃下、8 000 r·min-1離心15 min后除去上層凝固脂肪。

加酶凝乳：取100 g滅菌后脫脂乳，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)體系pH、溫度、復(fù)合酶添加量，添加酶時(shí)需充分?jǐn)嚢瑁估业鞍壮浞殖恋?，凝乳時(shí)間為5～25 min。

切割與滅活：凝乳時(shí)間結(jié)束后，迅速將凝乳劃分為1 cm×1 cm方塊以便乳清析出，加熱至70℃并保持10 min滅酶活處理，再冷卻至室溫。

過濾洗滌與干燥：將布氏漏斗連接到真空泵后對(duì)干酪素作抽濾，以5倍脫脂乳體積室溫下超純水洗滌過濾后，于38℃條件下干燥2.5 h，粉碎得成品。

酪蛋白出品率按下式計(jì)算：出品率（%）=（干酪素質(zhì)量/脫脂鮮牛乳質(zhì)量）×100%。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 復(fù)合酶混料設(shè)計(jì)

采用單純形格子設(shè)計(jì)模型，用Design-Expert 8.0軟件對(duì)胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶混合比例作設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定3種酶最適宜配比，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

在該混料設(shè)計(jì)中，設(shè)定基礎(chǔ)凝乳條件為復(fù)合酶添加量為0.010%（以原料脫脂乳質(zhì)量百分比計(jì)，wt%）、凝乳溫度45℃、pH 6.0，時(shí)間15 min?；旌厦赣葾（胃蛋白酶）、B（風(fēng)味蛋白酶）、C（中性蛋白酶）組成，3種酶占比總和A+B+C=1，設(shè)定上下限，即為0≤A≤1，0≤B≤1，0≤C≤1，研究不同組分配比對(duì)干酪素出品率影響。

1.3.3.2 復(fù)合酶制備干酪素單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取100.00 g新鮮脫脂乳，在復(fù)合酶添加量0.015%（其中胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶配比為混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果）、pH 6.0、凝乳溫度45℃、凝乳時(shí)間15 min條件下，保持其他工藝條件不變，改變其中任一個(gè)因素，以干酪素出品率為指標(biāo)，研究復(fù)合酶添加量（0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%）、凝乳溫度（35、40、45、50、55℃）、pH （5.7、6.0、6.3、6.6、6.9）和凝乳時(shí)間（5、10、15、20、25 min）對(duì)出品率影響，確定復(fù)合酶制備干酪素最佳凝乳條件，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.3 復(fù)合酶制備干酪素響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以Box-Behnken模型對(duì)試驗(yàn)作響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。試驗(yàn)以復(fù)合酶添加量（A）、凝乳溫度（B）、凝乳pH（C）和凝乳時(shí)間（D）為自變量，以干酪素出品率（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface test factor level table

1.3.4 常規(guī)理化指標(biāo)檢測

干酪素中蛋白質(zhì)測定參照GB 5009.5-2016，酪蛋白含量測定參照GB 31638-2016，脂肪含量測定參照GB 5009.6-2016、水分含量參照GB 50009.3-2016。

1.3.5 測定聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）

參見文獻(xiàn)[9]方法，采用12%分離膠濃度、5%濃縮膠濃度、酪蛋白濃度為2 mg·mL-1、上樣量為10 μL、濃縮膠部分電泳電壓為60 V、分離膠部分電泳電壓為100 V條件電泳，停止電泳后考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色2 h后脫色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.6 色度檢測

采用SC-80C型全自動(dòng)色差計(jì)測定，記錄測定結(jié)果以亮度值L*，紅度值a*值和黃度值b*值。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[10]檢測條件，準(zhǔn)確稱取2.0 mg蛋白樣品，與預(yù)先干燥溴化鉀粉末充分研磨后倒入模具，壓制成透明薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在掃描范圍為400～4 000 cm-1、分辨率為4 cm-1、掃描次數(shù)32次條件下掃描。在原譜圖分析特征結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，利用Peak Fit對(duì)紅外譜圖中酰胺Ⅰ區(qū)（1 700～1 600 cm-1）作二階導(dǎo)數(shù)譜圖擬合，以初步分析干酪素二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 25分析，Origin2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶混料試驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert 8.0軟件作混料設(shè)計(jì)，以胃蛋白酶（A），風(fēng)味蛋白酶（B），中性蛋白酶（C）為自變量，以干酪素出品率（Y）為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.0軟件處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

以干酪素出品率為指標(biāo)作二次多項(xiàng)式回歸，得到Y(jié)（出品率）與A（胃蛋白酶）、B（風(fēng)味蛋白酶）和C（中性蛋白酶）之間回歸方程模型。

設(shè)計(jì)復(fù)合酶混料試驗(yàn)，回歸方程模型作方差分析，結(jié)果見表3?？芍摶貧w方程模型極顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)P值為0.215，不顯著；模型決定系數(shù)R2為0.992，調(diào)整后決定系數(shù)Radj為0.984，信噪比30.263表明變量與響應(yīng)值擬合程度較好，該擬合方程可分析預(yù)測復(fù)合酶中各組分最優(yōu)比例。AB、AC和BC影響顯著（P＜0.0001），表明3種酶胃蛋白酶（A）、風(fēng)味蛋白酶（B）和中性蛋白酶（C）對(duì)出品率（Y）均有顯著影響，與響應(yīng)值間非簡單線性關(guān)系。3種凝乳酶交互作用見圖1。

由圖1可知，復(fù)合酶制備干酪素出品率明顯高于胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶單獨(dú)使用時(shí)的出品率，分別為2.04%、1.84%和1.94%。當(dāng)復(fù)合酶中胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶比例為0.33∶0.33∶0.33時(shí)，出品率最高可達(dá)2.45%，分別是單獨(dú)使用3種酶1.2倍、1.3倍和1.3倍，可見3種酶具有良好協(xié)同作用，酶解效率優(yōu)于單一酶。由3D圖可見，干酪素得率上升較緩慢，因?yàn)樵诓辉黾涌捎媒宦?lián)位點(diǎn)情況下，酪蛋白膠束崩解，延緩凝膠出現(xiàn)[11]。影響凝乳凝結(jié)速度主要因素之一是凝乳酶類型，而凝乳酶過度水解作用使干酪素出品率降低[12]。本研究表明，胃蛋白酶占比較高時(shí)，干酪素出品率較大。加入胃蛋白酶后，風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶過度水解作用得到緩解，提高干酪素出品率。

為檢驗(yàn)預(yù)測結(jié)果可靠性，通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)模型方程求解得到理想復(fù)合酶配比為胃蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶∶中性蛋白酶配比為0.41∶0.29∶0.30，在此條件下出品率理論值為2.45%，驗(yàn)證配比試驗(yàn)，重復(fù)3次，實(shí)際出品率為2.44%±0.041，與理論值吻合。該混料試驗(yàn)表明復(fù)合酶效率明顯高于單一種類蛋白酶。

表2 復(fù)合酶混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of compound enzyme mixture

表3 復(fù)合酶混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 3 Analysis of variance of compound enzyme mixture experiment design

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 復(fù)合酶添加量對(duì)出品率影響

復(fù)合酶添加量對(duì)出品率影響見圖2。

由圖2可知，隨酶添加量提高，酪蛋白出品率整體呈先升后降趨勢。當(dāng)酶添加量為0.015%時(shí)，出品率達(dá)到最高為2.83%；當(dāng)酶添加量超過0.015%后，復(fù)合酶添加量提高，出品率呈下降趨勢。牛奶中酪蛋白膠束主要通過靜電和空間排斥力而穩(wěn)定存在，歸因于κ-酪蛋白二硫化物聚合物形成具有強(qiáng)大N末端疏水核心外“毛狀層”[13]。凝乳酶凝乳作用則是通過裂解κ-酪蛋白導(dǎo)致膠束不穩(wěn)定和凝結(jié)[14]，當(dāng)凝乳酶添加量較小時(shí)，κ-酪蛋白與凝乳酶作用位點(diǎn)較少，此時(shí)凝乳效果較差。當(dāng)凝乳酶添加量過多時(shí)，過量凝乳酶導(dǎo)致酪蛋白過度水解，酪蛋白出品率降低。在凝乳酶添加量過少或過多時(shí)，凝乳易碎，機(jī)械性能較差，經(jīng)水洗后損失更多酪蛋白[15]。因此，本試驗(yàn)考慮酶添加量應(yīng)控制在0.015%。

2.2.2 凝乳溫度對(duì)出品率影響

由圖3可知，凝乳溫度由35℃升至45℃時(shí)，酪蛋白出品率隨溫度上升而增加，45℃時(shí)，出品率達(dá)最高2.81%，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，出品率呈下降趨勢。溫度對(duì)凝乳過程影響一般可分為對(duì)酶促反應(yīng)影響及對(duì)酪蛋白膠束影響。溫度升高導(dǎo)致凝乳酶失活，出品率降低。溫度過高時(shí)，凝乳酶底物酪蛋白膠束上κ-酪蛋白因加熱而減少，凝乳酶作用位點(diǎn)減少，降低干酪素出品率[16]。因此本試驗(yàn)最佳凝乳溫度選擇45℃。

2.2.3 凝乳pH對(duì)出品率影響

凝乳pH影響復(fù)合酶和酪蛋白膠束在溶液中解離狀態(tài)及構(gòu)象，適宜pH可穩(wěn)定凝乳酶活性，增加凝乳效果。

由圖4可知，pH 5.7～7.0，出品率隨pH升高先增后減，pH 6.0處得到最高出品率為2.84%。原因?yàn)閜H影響酶空間構(gòu)象使酶活性降低，影響酪蛋白膠束聚集速率，降低出品率。pH 6.0利于凝乳酶酶活性，增加酪蛋白膠束聚集速率[17]。當(dāng)溶液pH偏離酶最適pH后，酶空間構(gòu)象發(fā)生顯著變化，酶活性降低，凝乳能力顯著下降[18]。因此，本試驗(yàn)復(fù)合酶凝乳最適pH 6.0。

2.2.4 凝乳時(shí)間對(duì)出品率影響

凝乳時(shí)間對(duì)出品率影響見圖5。

由圖5可知，隨凝乳時(shí)間延續(xù)，出品率呈先增后減趨勢，原因?yàn)榉磻?yīng)初期凝乳酶與蛋白結(jié)合位點(diǎn)較多，酶切位點(diǎn)減少，出品率下降。10 min時(shí)，出品率最高為2.85%。隨凝乳時(shí)間延續(xù)，酪蛋白被酶水解，出品率下降[19]。凝乳時(shí)間過長，降低酪蛋白膠束表面靜電荷，導(dǎo)致凝乳中乳清大量析出，凝乳變硬，出品率下降[20]。因此，該復(fù)合酶最適凝乳時(shí)間選擇10 min。

2.3 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0軟件作中心組合設(shè)計(jì)，通過Box-Behnken模型，以復(fù)合酶添加量（A）、凝乳溫度（B）、凝乳pH（C）和凝乳時(shí)間（D）為自變量，以干酪素出品率（Y）為響應(yīng)值，通過Design Expert 8.0.6作試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，見表4。

經(jīng)回歸擬合后獲得復(fù)合酶添加量（A）、凝乳溫度（B）、凝乳pH（C）和凝乳時(shí)間（D）二次回歸模型方程為：Y=2.89+0.087A-0.11B-0.068C-0.10D+0.20AB+0.061AC+0.077AD-0.058BC+0.029BD+0.051CD-0.16A2-0.18B2-0.20C2-0.12D2。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface experimental design and results

續(xù)表

應(yīng)用Design Expert8.0.6軟件，方差分析方程和各因子，結(jié)果見表5。

由表5可知，該回歸模型變量間關(guān)系極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)（P＞0.05）不顯著，模型RAdj為0.9307，R2=0.9654，說明該模型試驗(yàn)誤差較小，擬合程度高，利用該回歸方程模型優(yōu)化復(fù)合酶制備干酪素工藝可行。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可見，一次項(xiàng)A（復(fù)合酶添加量）、B（凝乳溫度）、C（凝乳pH）、D（凝乳時(shí)間）顯著，二次項(xiàng)AB、A2、B2、C2和D2極顯著（P＜0.01），AC、AD和BC顯著（P＜0.05），因此干酪素出品率變化復(fù)雜，各因素對(duì)出品率影響非簡單線性關(guān)系。各因素對(duì)出品率（Y）影響依次為：B（凝乳溫度）＞D（凝乳時(shí)間）＞A（復(fù)合酶添加量）＞C（凝乳pH）。

表5 響應(yīng)面模型方差分析Table 5 Response surface model variance analysis

由圖6a可知，復(fù)合酶添加量（A）和凝乳溫度（B）存在極顯著交互作用。隨復(fù)合酶添加量和凝乳溫度上升，干酪素出品率呈先升后降趨勢。凝乳酶主要通過水解酪蛋白Phe 105-Met 106肽鍵，促進(jìn)凝乳。酶量和溫度增加，可提高凝乳酶活力和凝乳反應(yīng)速率。結(jié)合響應(yīng)面可見，復(fù)合酶添加量少，凝乳溫度低時(shí)，干酪素出品率較低，與單因素分析一致，但過高溫度和酶添加量降低酶活力，出品率下降，與吳晗等優(yōu)化牦牛乳酸凝干酪制備工藝[21]研究結(jié)果一致。由圖6b可知，干酪素出品率隨復(fù)合酶添加量和pH增加先升高，添加量約為0.015%時(shí)達(dá)到最大值后下降。由圖6c可知，干酪素出品率隨復(fù)合酶添加量增加呈先升后降趨勢，因凝乳酶水解作用降低出品率。由圖6d可知，干酪素得率隨溫度和pH增加呈先升后降趨勢，因較低pH下凝乳酶水解酪蛋白作用較弱，出品率較高，而在中性條件下，水解作用較強(qiáng)，導(dǎo)致出品率下降[22]。由圖6e可知，干酪素得率隨脫脂乳pH和凝乳時(shí)間改變，出品率先增后減。劉佳等也證實(shí)凝乳時(shí)間過長或過短影響凝乳質(zhì)地，增加水洗過程中損失，導(dǎo)致出品率降低[23]。

綜合單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得到使用該復(fù)合酶制備酪蛋白最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.014%，凝乳溫度48.09℃，脫脂乳pH5.98，凝乳時(shí)間11.57 min，在此條件下酪蛋白理論出品率為2.94%。為方便試驗(yàn)操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為：酶添加量0.014%，溫度48℃，pH 6.0，時(shí)間11.5 min。按照調(diào)整后工藝參數(shù)作驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），結(jié)果為酪蛋白得率2.90±0.052%，與預(yù)測值2.94%接近。

2.3 常規(guī)理化指標(biāo)檢測結(jié)果

將復(fù)合酶制備干酪素與小牛皺胃酶制備干酪素作相關(guān)理化指標(biāo)檢測，結(jié)果見表6?？梢?，復(fù)合酶酪蛋白與小牛皺胃酶酪蛋白相比，蛋白質(zhì)和酪蛋白含量略低，脂肪和水分含量略高，但差異不顯著，均符合GB 3168-2016要求。但本試驗(yàn)制備復(fù)合酶成本低于小牛皺胃酶，具有開發(fā)前景。

表6 復(fù)合酶制備酪蛋白與小牛皺胃酶制備酪蛋白理化指標(biāo)差異Table 6 Differences in physicochemical indices between casein prepared by mixed protease and casein prepared by calf rennet(%)

2.4 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖7所示。酪蛋白電泳譜圖主要包括分子質(zhì)量＜25 ku κ-酪蛋白條帶，25～35 ku αs-酪蛋白條帶和β-酪蛋白條帶。由兩個(gè)泳道條帶位置一致，帶寬接近，說明兩種酪蛋白主要組分一致，無明顯差異。

2.5 色度分析

色澤是評(píng)價(jià)干酪素品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)之一，引起干酪素色澤變化主要因素為美拉德反應(yīng)和脂質(zhì)氧化[24]。a*值、b*值越大，表明紅色度和黃色度越高；L*值越大，表明亮度越高，干酪素品質(zhì)越好。由表7可知，小牛皺胃酶制備干酪素與復(fù)合酶制備干酪素在色度上差異不顯著，說明該復(fù)合酶制備干酪素色澤較好，較接近小牛皺胃酶制備干酪素。

2.6 紅外光譜分析

將小牛皺胃酶制備酪蛋白與復(fù)合酶制備酪蛋白用傅里葉變換紅外光譜儀檢測，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，兩種酪蛋白之間，各特征峰之間位置、峰形十分接近，說明兩者組成一致。在3 400 cm-1處有N-H伸縮振動(dòng)和O-H振動(dòng)，復(fù)合酶制備干酪素3 400 cm-1呈較寬吸收峰，可能是干酪素中存在大量分子內(nèi)或分子間氫鍵造成。在2 960 cm-1處有CH3不對(duì)稱拉伸振動(dòng)，2 885～2 865 cm-1處有CH3對(duì)稱振動(dòng)，1 654 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)，1 541 cm-1處有C-N伸縮振動(dòng)和N-H變形振動(dòng)，1 470～1 440 cm-1處有CH3不對(duì)稱變形振動(dòng)，1 443 cm-1處有C-N伸縮在1 390～1 370 cm-1處CH3振動(dòng)分裂為兩個(gè)峰，說明有C上連接1個(gè)以上甲基。以上均為蛋白質(zhì)分子特征吸收峰[25]，說明采用復(fù)合酶制備干酪素與小牛皺胃酶制備干酪素組成接近，不同酶處理并未改變干酪素結(jié)構(gòu)。

根據(jù)王曉琳等1 700～1 600 cm-1酰胺Ⅰ區(qū)譜圖作二階導(dǎo)數(shù)分析可預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[26]。對(duì)二階導(dǎo)數(shù)譜圖使用Peak Fit軟件擬合，擬合后峰面積分析得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)占比，其中1 660～1 650，1 640～1 620，1 690～1 670，1 650～1 640 cm-1擬合后峰面積之和分別代表α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所占比例。兩種酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中各部分占比見表8。

表7 小牛皺胃酶制備酪蛋白與復(fù)合酶制備酪蛋白色度Tabie 7 Chroma of casein prepared by calf rennet and casein prepared by complex enzyme

表8 復(fù)合酶干酪素與小牛皺胃酶干酪素二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 8 Secondary structure composition of casein with complex enzyme and calf rennet casein （g·100 g-1）

通過分析二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩種酪蛋白，在α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲所占二級(jí)結(jié)構(gòu)比例上存在差異。與小牛皺胃酶制備酪蛋白相比，復(fù)合酶制備干酪素α-螺旋含量略多，β-折疊顯著增多，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲略降。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯著影響酪蛋白分子三維空間結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)最緊湊，空間排布有序，不包含空腔結(jié)構(gòu)，β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)α-螺旋更松散，但三維空間排布有序，無規(guī)則卷曲則為無序松散結(jié)構(gòu)[27]，復(fù)合酶制備干酪素?fù)碛懈唳?螺旋與更少無規(guī)則卷曲，表明其三維空間結(jié)構(gòu)更致密，性質(zhì)更穩(wěn)定。

3 結(jié)論

以鮮牛乳為原料，通過多酶復(fù)合試驗(yàn)確定胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶最佳配比為0.41∶0.29∶0.30，干酪素出品率可達(dá)2.44%。再根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合酶制備干酪素工藝條件參數(shù)，各因素對(duì)干酪素出品率影響依次為凝乳溫度＞凝乳時(shí)間＞復(fù)合酶添加量＞凝乳pH，得到最佳干酪素制備條件，經(jīng)驗(yàn)證，酶添加量0.014%，溫度48℃，pH 6.0，時(shí)間11.5 min條件下出品率為2.90%±0.052%，與理論值接近。將復(fù)合酶制備干酪素與小牛皺胃酶制備干酪素相比，兩者在紅外光譜特性等理化指標(biāo)上差異不顯著，均符合酪蛋白產(chǎn)品質(zhì)量要求，表明本試驗(yàn)制備干酪素品質(zhì)較高，所需凝乳酶來源廣、價(jià)格低，可降低高品質(zhì)干酪素生產(chǎn)成本。