CD24在早期宮頸癌中的作用機(jī)制及臨床價值探索

孫培松，李博涵，申彥，張雯雯，曲芃芃

宮頸癌發(fā)病率在婦女惡性腫瘤中位居第三，絕大多數(shù)死亡病例發(fā)生于發(fā)展中國家。流行病學(xué)資料以及實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)明確高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌前病變及宮頸癌的必要條件[1]。隨著HPV疫苗的應(yīng)用、檢測技術(shù)的不斷進(jìn)展及篩查策略的不斷成熟，目前宮頸癌的預(yù)防成效顯著。將HPV檢測作為宮頸病變的初篩手段已逐步成為諸多國家宮頸癌篩查的共識。對于持續(xù)HR-HPV陽性患者的宮頸病變風(fēng)險監(jiān)測逐漸受到人們的重視，發(fā)現(xiàn)持續(xù)HR-HPV感染進(jìn)展為癌前病變進(jìn)而發(fā)展為宮頸癌的熱點(diǎn)基因意義重大，可以成為早期干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)[2-3]。

本研究通過生物信息學(xué)方法，檢索并發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織與宮頸癌組織中差異表達(dá)基因指向分化抗原簇蛋白 24（cluster of differentiation 24，CD24），該基因最初被認(rèn)為是人體內(nèi)連接糖基化磷脂酰肌醇的B細(xì)胞相關(guān)抗原，也被用作B細(xì)胞和胸腺細(xì)胞標(biāo)志物。隨后研究發(fā)現(xiàn)CD24在卵巢癌、食道癌、結(jié)腸癌、膽管癌、肺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等多種人類癌癥中異常表達(dá)，且與患者生存率較低相關(guān)[4-5]。但CD24與宮頸癌的關(guān)系少有報道，本研究進(jìn)一步探究CD24與宮頸癌臨床病理聯(lián)系以及與宮頸癌無進(jìn)展生存期（DFS）及總生存期（OS）的關(guān)系，以此來評估CD24作為宮頸病變預(yù)測指標(biāo)的臨床價值，并對CD24的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選用通量癌基因數(shù)據(jù)庫TCGA門戶網(wǎng)站GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）以及 UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://UALCAN//ualcan.path.uab.edu/）。

1.2 差異基因篩選 通過TCGA門戶網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn/）進(jìn)行差異基因分析、基因的篩選以及臨床預(yù)后分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：在早期宮頸癌（Ⅰ期）患者中高表達(dá)的基因。排除標(biāo)準(zhǔn)：在陰道宮旁浸潤宮頸癌（Ⅱ期）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性宮頸癌（Ⅲ期+Ⅳ期）患者中的表達(dá)高于在早期宮頸癌患者中表達(dá)的基因。之后通過差異倍數(shù)及P值選取差異性較高的基因，通過文獻(xiàn)分析其中可能具有較高臨床意義的基因作為目的基因。并通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://UALCAN//ualcan.path.uab.edu/）進(jìn)行數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

1.3 免疫組織化學(xué)（免疫組化） 病理診斷按世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，選取2019年6月—2020年3月天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院（我院）就診的患者中正常宮頸上皮組織、高級別宮頸上皮內(nèi)病變[HSIL，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅱ～Ⅲ]組織、ⅠA期宮頸癌組織石蠟切片各5例?；颊吣挲g為43～60歲，正常宮頸上皮組織均來自因子宮腺肌病行子宮全切術(shù)的患者。進(jìn)行CD24免疫組織化學(xué)染色：切片脫蠟水化、抗原修復(fù)、封閉、滴加一抗[CD24（博奧森 bs-23867R）1∶200 稀釋]、滴加二抗、DAB顯色。

1.4 蛋白互作關(guān)系分析 蛋白互作關(guān)系通過string數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行分析。交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4，最大交互因子設(shè)定為不超過20個交互因子。并通過GO數(shù)據(jù)庫以及KEGG數(shù)據(jù)庫對交互因子進(jìn)行富集分析，篩選富集功能及通路。

1.5 核心基因的選擇 采用cytoscape中的cytohubba工具，對string數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并采用計算公式（MCC方法）選出連接點(diǎn)最為集中的前3位核心基因。

1.6 GO以及KEGG富集分析 將string數(shù)據(jù)庫中分子間關(guān)聯(lián)進(jìn)行GO富集分析，并通過R語言中的GOplot及string軟件包結(jié)合各分子在宮頸癌及正常人群中的表達(dá)差異倍數(shù)篩選上調(diào)基因及富集通路。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 定量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗(yàn)分析宮頸癌患者CD24表達(dá)水平對DFS和OS的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GO以及KEGG富集分析采用矯正后P值，矯正后P＜0.05為富集結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選 通過TCGA分析發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織與宮頸癌組織之間存在2 094個差異基因。根據(jù)研究目的對正常組與早期宮頸癌組（Ⅰ期）進(jìn)行差異基因分析，得到248個差異基因；并分析早期宮頸癌組（Ⅰ期）與陰道宮旁浸潤組（Ⅱ期）以及宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（Ⅲ期+Ⅳ期）的差異基因，分別發(fā)現(xiàn)346個和468個差異基因，將其與正常組和早期宮頸癌組的差異基因取交集并予以排除?？紤]剩余基因主要與早期腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)，共計剩余53種，再選擇出差異倍數(shù)＞16倍且P＜0.01的基因。通過進(jìn)一步查詢文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)CD24可能具有較高的臨床價值，因而將其作為目的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。差異基因篩選流程見圖1。

圖1 差異基因篩選流程圖

2.2 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證CD24臨床表達(dá) 通過對UALCAN數(shù)據(jù)庫中患者信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因CD24在宮頸癌組織（n=298）中的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織（n=3，P＜0.01）。根據(jù)臨床分期對患者進(jìn)行分組并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CD24在早期宮頸癌（Ⅰ期）組織（n=161）中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織（n=3，P＜0.05），說明 CD24在宮頸癌早期發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用；CD24在Ⅰ期（n=161）與Ⅱ期宮頸癌患者（n=69）、Ⅰ期（n=161）與Ⅲ期及Ⅳ期（n=68）宮頸癌患者之間的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），且均值略低于早期宮頸癌表達(dá)水平，說明CD24可能不是驅(qū)動宮頸癌進(jìn)一步浸潤及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因。見圖2。

將CD24中位數(shù)作為閾值，分別將宮頸癌患者分為CD24高表達(dá)組及CD24低表達(dá)組。通過未加權(quán)生存分析發(fā)現(xiàn)，2組DFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.49），但CD24高表達(dá)組的OS顯著低于CD24低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.045），其可能與患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。見圖3（見后插二）。

2.3 HSIL與早期宮頸癌中CD24表達(dá)差異分析 對我院收集的宮頸正常者、HSIL患者以及早期宮頸癌患者的宮頸組織進(jìn)行免疫組化分析，觀察3組CD24表達(dá)的差異。棕色為免疫組化染色陽性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD24在HSIL以及早期宮頸癌患者中表達(dá)逐漸增加，在早期宮頸癌患者的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而在HSIL與正常宮頸組織分別為弱陽性及陰性。見圖4（見后插二）。

2.4 CD24對于早期宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制探索 通過string數(shù)據(jù)庫對CD24進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)各分子互作關(guān)系網(wǎng)見圖5（見后插二）。通過cytoscape對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而對其中起主要調(diào)控作用的核心基因進(jìn)行篩選，共篩選出3個核心基因，其節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)性排名依次為CD24、CD44以及TP53，見圖6（見后插二）。

進(jìn)一步的CD24及其相關(guān)核心基因?qū)?yīng)蛋白的GO富集分析結(jié)果包括生物過程（GO-BP）、分子功能（GO-MF）、細(xì)胞成分（GO-CC），見表1。其中GO-BP主要富集于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)正調(diào)控以及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)正調(diào)控，兩者均與激活或增加細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的頻率、速率或程度的生物過程相關(guān)；GO-MF提示其主要功能與蛋白結(jié)合以及酶結(jié)合結(jié)構(gòu)相關(guān)；GO-CC分析提示CD24基因?qū)?yīng)蛋白主要位于細(xì)胞表面以及脂膜外側(cè)。根據(jù)基因表達(dá)差異分析其對應(yīng)蛋白功能均為正調(diào)控，見圖7（見封三）。

圖2 CD24表達(dá)差異數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證

進(jìn)一步對CD24基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果提示其與癌癥發(fā)展的信號通路密切相關(guān)：包括癌癥通路以及癌癥的微小RNA（microRNAs）通路，之后在磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路發(fā)生富集（矯正后P＜0.05）。根據(jù)KEGG注釋該通路由生長因子與其受體酪氨酸激酶結(jié)合后激活調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖等功能，同時也是腫瘤增殖生長的重要通路之一。見圖8（見封三）。

表1 CD24及其相關(guān)基因?qū)?yīng)蛋白的GO富集分析結(jié)果

圖3 CD24表達(dá)在宮頸癌患者中的生存曲線分析

圖4 CD24在正常宮頸組織、HSIL以及早期宮頸癌組織中的表達(dá)（免疫組化×100）

圖5 CD24蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 CD24及其相關(guān)核心基因作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 CD24及其相關(guān)基因?qū)?yīng)蛋白GO功能富集分析

圖8 CD24及其相關(guān)蛋白KEGG通路分析

3 討論

近年來，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念對醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了巨大影響，尤其在腫瘤領(lǐng)域。針對宮頸癌同樣有許多相關(guān)的生物信息技術(shù)分析，由于公共數(shù)據(jù)庫的局限以及目前的關(guān)注熱點(diǎn)，大多數(shù)的數(shù)據(jù)挖掘分析集中于潛在的治療靶點(diǎn)以及影響宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)[6]，較少有生物信息研究集中于早期宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及宮頸病變預(yù)測指標(biāo)。

CD24又稱熱穩(wěn)定抗原，是一種高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇錨定表面蛋白，已知與先天免疫細(xì)胞上的 SIGLEC10（sialic-acid-binding Ig-like lectin 10）相互作用，抑制響應(yīng)感染、敗血癥、肝損傷和慢性移植物抗宿主疾病的破壞性炎癥反應(yīng)[7-8]。然而，也有研究顯示CD24表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤，但該分子在調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)中的作用尚未被證實(shí)[9-10]。

本研究通過設(shè)計篩選流程，分析正常組與早期宮頸癌組（Ⅰ期）之間的差異基因，并分析早期宮頸癌組（Ⅰ期）與陰道宮旁浸潤組（Ⅱ期）以及宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（Ⅲ期+Ⅳ期）的差異基因，予以排除。從臨床病理角度篩選出可能與宮頸癌變發(fā)生、發(fā)展相關(guān)并可能作為宮頸病變預(yù)測指標(biāo)的基因——CD24。通過其他數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證該基因表達(dá)變化主要發(fā)生于宮頸癌早期。隨后，研究通過免疫組化分析正常、HSIL以及早期宮頸癌患者宮頸組織CD24的表達(dá)差異，結(jié)果與數(shù)據(jù)發(fā)掘的假設(shè)結(jié)果相符，即正常宮頸組織的CD24表達(dá)較低，而在宮頸病變及早期宮頸癌中表達(dá)逐漸上升，考慮其可能作為臨床預(yù)測宮頸病變進(jìn)展的潛在指標(biāo)。為了進(jìn)一步尋找依據(jù)，本研究通過公共數(shù)據(jù)庫對CD24的可能作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的分析挖掘。通過string數(shù)據(jù)庫分析以及核心基因的計算，發(fā)現(xiàn)CD24的功能與CD44以及TP53基因密切相關(guān)。根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫注釋，CD44主要與細(xì)胞間黏附力相關(guān)，而TP53則是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中極為重要的因子之一。為了進(jìn)一步探究CD24基因的功能，本研究進(jìn)行了GO富集分析，其主要富集于信號通路正調(diào)控，通過GO注釋以及文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤通路相關(guān)基因，包括表皮生長因子通路以及PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因均有許多富集于此功能區(qū)，該功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。最后，研究進(jìn)行了KEGG信號通路富集分析，富集結(jié)果與GO富集分析結(jié)果相互印證。考慮CD24可能通過PI3K-Akt信號通路影響宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。

目前，在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)CD24往往與CD44共同表達(dá)，可作為宮頸腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白之一[5,13]。與成熟的宮頸細(xì)胞相比，CD24高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞往往同時表達(dá)低分化細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白波形蛋白以及oct4，提示CD24可能與宮頸細(xì)胞的去分化過程存在一定的相關(guān)性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CD24高表達(dá)的SiHa細(xì)胞增殖速度增加，且抗凋亡能力更強(qiáng)，與本研究分析的結(jié)果相符。同時，部分研究發(fā)現(xiàn)CD24高表達(dá)可能增加宮頸癌細(xì)胞抗照射能力，使腫瘤對放療的敏感度降低，從而影響宮頸癌患者的治療效果及預(yù)后[5,14]。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫門戶分析出對于早期宮頸癌發(fā)生、發(fā)展較為重要的基因CD24，并通過免疫組化首次驗(yàn)證了CD24在HSIL以及早期宮頸癌中的表達(dá)水平升高，為臨床宮頸病變風(fēng)險預(yù)測提供新的可能指標(biāo)。但是本研究為初部探索性研究，納入的病例較少，因而無法進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，在之后的研究中將進(jìn)一步增加樣本量，同時對納入患者展開前瞻性研究，探討CD24表達(dá)對患者的長期影響。

綜上所述，考慮CD24在早期宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可通過增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。同時，由于CD24在宮頸病變以及癌組織中的差異表達(dá)，其可能具有宮頸病變風(fēng)險預(yù)測的臨床意義。隨后課題組將針對CD24進(jìn)行進(jìn)一步的研究以及臨床隨訪，探究CD24在宮頸病變臨床預(yù)測中的臨床價值。