地塞米松注射液聯(lián)合葡萄糖高滲液對兔眼角膜內(nèi)皮的保護(hù)作用

李 彪，尹 利，曲 超，2

0引言

目前，白內(nèi)障仍然是全世界第一大致盲眼病，隨著現(xiàn)代生活水平逐步提高，醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展進(jìn)步，人類平均壽命的延長，白內(nèi)障發(fā)病率和患病率呈逐年遞增趨勢[1]。手術(shù)依然是治療白內(nèi)障最有效的途徑[2]，白內(nèi)障超聲乳化術(shù)因?yàn)橹委熜Ч?、手術(shù)時(shí)間短、創(chuàng)傷小、產(chǎn)生術(shù)源性散光低、術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)近年來被眼科醫(yī)生廣泛采用[3-4]，然而超聲乳化術(shù)后的一系列并發(fā)癥影響了手術(shù)效果，角膜水腫是其中最常見的術(shù)后并發(fā)癥之一[5]，國外有研究者報(bào)道超聲乳化術(shù)后角膜水腫的發(fā)生率為12.7%[6]。角膜內(nèi)皮細(xì)胞在維持角膜正常厚度、透明性方面起著重要作用[7]，常規(guī)超聲乳化手術(shù)由于超聲乳化的能量及乳化顆粒的機(jī)械損傷均會(huì)引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量不同程度下降。但是通常角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量>1500cells/mm2手術(shù)都是安全的。以往的共識(shí)認(rèn)為角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量<1500cells/mm2可以考慮白內(nèi)障囊外摘除(extracapsular cataract extraction，ECCE)，但是隨著手術(shù)設(shè)備的優(yōu)化，手術(shù)技巧的日趨完善，很多術(shù)者在探尋角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的最低界限，目前角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量在400～800cells/mm2被認(rèn)為是一個(gè)界限值。

超聲乳化術(shù)中，角膜內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，術(shù)后早期細(xì)胞的能量主要用于兩方面：(1)自身修復(fù)；(2)Na+-K+ATP泵工作，保持角膜脫水狀態(tài)。因此如果術(shù)后早期(術(shù)后0～24h)使用高滲液保持角膜的脫水狀態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞將節(jié)省出更多的能量，用于自身修復(fù)。我們在臨床觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第1d早上，通常是角膜能否經(jīng)受手術(shù)考驗(yàn)的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，如果術(shù)后第1d早上角膜透明，則角膜水腫不會(huì)再有加重。如果角膜水腫，高滲液的使用時(shí)間可能是病情的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。本研究采用兔作為研究對象，探討地塞米松聯(lián)合高滲液對兔眼角膜內(nèi)皮的早期保護(hù)作用，為臨床治療角膜水腫，防止角膜內(nèi)皮失代償提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康成年日本大耳白兔20只40眼(四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.2kg，均在裂隙燈顯微鏡下檢查，排除有眼部疾病者。按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C、D四組(每組5只10眼)。本研究通過四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查[No.倫審(研)2019年第273號(hào)]。

1.1.2主要試劑葡萄糖高滲液(50%葡萄糖注射液與維生素C注射液按5∶1比例配制，無菌操作，現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃恒溫冰箱保存)；0.2%地塞米松注射液(辰欣藥業(yè))；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥)。

1.1.3主要儀器眼科手術(shù)顯微鏡(Zessis S88，Zessis Corporation，German)；裂隙燈光學(xué)顯微鏡(Topcon Corproration，Janpan)；A超角膜厚度測量儀(Pachymeter SP-3000，Japan)；相干光斷層掃描成像系統(tǒng)(RTVuee100-2，America)；角膜內(nèi)皮儀(Topcon SP-3000P，Janpan)。

1.2方法

1.2.1角膜水腫動(dòng)物模型建立造模前用角膜厚度測量儀測量角膜中央厚度(CCT)，角膜內(nèi)皮儀測量角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)，前節(jié)OCT檢查角膜。所有兔均采用30mg/mL戊巴比妥溶液(1mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉，待進(jìn)入全麻狀態(tài)后，將其側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，術(shù)眼常規(guī)消毒鋪巾。開瞼器開瞼，聚維酮碘+生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，0.4%鹽酸奧布卡因1滴滴于結(jié)膜囊行表面麻醉，顯微齒鑷固定眼球，用2.4mm角膜穿刺刀分別于12∶00、3∶00位透明角膜緣做自閉性切口，前房維持器連接接有平衡液與滅菌注射用水按3∶7比例(基于前期實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，該比例既能建立兔眼角膜水腫模型，又不會(huì)導(dǎo)致兔眼角膜內(nèi)皮失代償)配制的低滲液輸液器，瓶高75cm，從12∶00位進(jìn)入前房，斜口朝向晶狀體但不接觸晶狀體及角膜，維持前房灌注，并用鈍性針頭穿刺入3∶00位切口，保持引流通暢，防止眼壓過高，并于顯微鏡下觀察角膜水腫情況，維持前房灌注10min。角膜霧樣水腫，則造模成功。若實(shí)驗(yàn)操作過程中刺傷晶狀體或角膜，則按要求重新補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2.2造模后處理A組：造模后立即予以地塞米松注射液0.2mL結(jié)膜下注射，高滲葡萄糖液按15min/次頻繁點(diǎn)眼；B組：造模后立即予以0.9%生理鹽水0.2mL結(jié)膜下注射，平衡鹽溶液按15min/次頻繁點(diǎn)眼；C組：造模后第2d予以地塞米松注射液0.2mL結(jié)膜下注射，高滲葡萄糖按15min/次頻繁點(diǎn)眼；D組：造模后第2d予以0.9%生理鹽水0.2mL結(jié)膜下注射，平衡鹽溶液按15min/次頻繁點(diǎn)眼。各組滴眼液滴眼每天持續(xù)8h，共7d。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1兔眼角膜裂隙燈顯微鏡下觀察造模后第1、3、5、7d于裂隙燈下觀察兔眼角膜水腫情況，參考文獻(xiàn)[8]將角膜水腫程度分為0～4級(jí)：0級(jí)，角膜完全透明，無水腫；1級(jí)，角膜輕度水腫，可觀察到虹膜、晶狀體細(xì)節(jié)；2級(jí)，角膜中度水腫，可觀察到虹膜、晶狀體；3級(jí)，嚴(yán)重的角膜水腫，無法觀察到晶狀體；4級(jí)，彌漫角膜水腫，無法觀察到虹膜。

1.2.3.2兔眼CCT測量超聲測厚法是臨床上應(yīng)用最廣泛的CCT測量方法[9]，被公認(rèn)為是角膜厚度測量的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。造模后第1、3、5、7d行裂隙燈檢查后測量CCT，具體方法為將兔固定于專用固定架上，以0.4%鹽酸奧布卡因表面麻醉后，使用A超角膜厚度測量儀測量CCT，測量5次取平均值。

1.2.3.3兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)造模后第1、3、5、7d全身麻醉后采用角膜內(nèi)皮儀行角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查，測量角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3.4兔眼前節(jié)OCT檢查造模后第1、3、5、7d全身麻醉后行前節(jié)OCT檢查，觀察兔眼角膜水腫情況。

2結(jié)果

2.1兔眼角膜裂隙燈顯微鏡下觀察造模前，各組兔眼角膜透明(圖1A)。造模后，A組兔眼在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察中角膜保持透明，水腫程度為0～1級(jí)(圖1B)；C組兔眼造模后第1d角膜水腫最明顯，為2～3級(jí)(圖1D)，其后逐漸消退；B、D組兔眼造模后角膜水腫明顯，至造模后第3d最顯著，為3～4級(jí)(圖1C、1E)，最長消退時(shí)間為造模后21d，角膜基本恢復(fù)透明，未出現(xiàn)角膜大泡性病變，考慮與兔眼角膜內(nèi)皮可再生有關(guān)。造模前后各組兔眼角膜水腫程度分級(jí)見圖2。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)兔造模后第3d裂隙燈下觀察角膜水腫情況 A：造模前，角膜透明；B：A組，角膜透明；C：B組，角膜彌漫水腫，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)窺不清；D：C組，角膜水腫，但尚可觀察到虹膜；E：D組, 角膜彌漫水腫，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)窺不清。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)兔在不同觀察時(shí)間點(diǎn)角膜水腫程度。

2.2兔眼角膜中央厚度測量結(jié)果造模前后不同時(shí)間點(diǎn)各組兔眼CCT測量結(jié)果比較具有時(shí)間差異性(F=1514.703，P<0.05)和組間差異性(F=801.98，P<0.05)，且不同組在不同時(shí)間上的變化趨勢具有差異性(F=29.402，P<0.05)，見表1～3。造模前，各組兔眼CCT測量結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后，A組兔眼CCT在實(shí)驗(yàn)過程中變化不明顯；C組兔眼CCT在造模后第1d最高，其后逐漸下降；B、D組兔眼CCT明顯增加，在造模后第3d增加最明顯，其后逐漸緩慢下降。

表1 各組兔眼在不同時(shí)間測量的CCT值

表2 各組兔眼不同時(shí)間CCT的比較 P值

表3 不同時(shí)間各組兔眼CCT的比較 P值

2.3兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞測量結(jié)果造模前，各組兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為2979.6±273.3、2947.4±210.3、3002.3±145.1、3017.8±125.3cells/mm2，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.272，P>0.05)。造模后第1、3、5、7d，A組兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)分別為2962.9±223.4、2984.9±232.6、2991.2±243.0、2983.7±251.1cells/mm2，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.02，P>0.05)；造模后第7d，C組兔眼可測出角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)為2821.8±141.1cells/mm2，與C組造模前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.498，P<0.05)，與A組造模后第7d相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.024，P<0.05)；B、D組兔眼由于角膜水腫在觀察期間無法測出角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。

2.4兔眼前節(jié)OCT檢查情況兔眼前節(jié)OCT圖像可見，造模前各組兔眼角膜厚度正常(圖3A)；造模后，A組兔眼角膜無明顯增厚(圖3B)，C組兔眼角膜輕度增厚(圖3D)，B、D組兔眼角膜基質(zhì)明顯水腫，厚度增加，超過OCT自動(dòng)測厚上限(800μm)(圖3C、3E)。

圖3 各組實(shí)驗(yàn)兔造模后第3d前節(jié)OCT檢查結(jié)果 A：造模前，角膜厚度正常；B：A組，角膜厚度正常；C：B組，角膜明顯增厚，超過OCT自動(dòng)測厚上限；D：C組，角膜輕度增厚；E：D組，角膜明顯增厚，超過OCT自動(dòng)測厚上限。

3討論

角膜內(nèi)皮細(xì)胞在維持角膜透明性方面具有十分重要的作用。角膜內(nèi)皮由一層厚約5μm的六角形扁平細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙連接及基質(zhì)構(gòu)成機(jī)械屏障連同細(xì)胞的離子泵功能，可防止過多水分進(jìn)入角膜基質(zhì)并將多余水分主動(dòng)排出細(xì)胞從而維持角膜透明。人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量約2800～4000cells/mm2，并隨著年齡增加而逐漸減少，一般以每年0.6%的速度下降。此外，外傷、青光眼、糖尿病及多種角膜原發(fā)病如Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良、Peters異常、圓錐角膜[11]等均可造成角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷。人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞不可再生，損傷后將由周圍的細(xì)胞擴(kuò)大、移行代償其功能。Goktas等[12]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的危險(xiǎn)閾值是1000cells/mm2，當(dāng)細(xì)胞密度低于閾值時(shí)，角膜水腫的發(fā)生率成倍增長，若損傷導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，低于臨界值，殘余細(xì)胞將不能代償其功能，可導(dǎo)致角膜內(nèi)皮失代償，發(fā)生嚴(yán)重角膜水腫，甚至角膜大泡性病變。目前對于術(shù)后角膜水腫的治療主要有藥物治療，包括類固醇激素、非甾體抗炎類藥物、重組人表皮生長因子滴眼液、谷胱甘肽、高滲液等，其中類固醇激素具有強(qiáng)大的抗炎作用，可抑制免疫反應(yīng)，抑制炎性滲出，保護(hù)受損傷的細(xì)胞，而高滲液是輔助內(nèi)皮細(xì)胞完成角膜脫水狀態(tài)的一種重要物質(zhì)，可能幫助內(nèi)皮細(xì)胞節(jié)約能量，從而使內(nèi)皮細(xì)胞有更多的能量用于自身修復(fù)。

我們推測超聲乳化術(shù)后早期內(nèi)皮細(xì)胞損傷最重，細(xì)胞剛剛經(jīng)歷了手術(shù)損傷，包括超聲能量[13]、超聲乳化產(chǎn)生的熱量、皮質(zhì)碰撞等機(jī)械性損傷、灌注液的損傷[14]等。術(shù)后早期，內(nèi)皮細(xì)胞的生存環(huán)境也相對惡劣，前房的微環(huán)境處于恢復(fù)狀態(tài)，房水pH值、滲透壓、電解質(zhì)及其他物質(zhì)的含量都在逐步回歸正常狀態(tài)。因此，術(shù)后保護(hù)細(xì)胞的治療應(yīng)該在手術(shù)結(jié)束后立即進(jìn)行。同樣的治療措施，使用的時(shí)間不同，可能是完全不同的結(jié)果。本研究中，A組和C組采用同樣的藥物，但是不同的給藥時(shí)間，A組造模結(jié)束后，立即進(jìn)行藥物保護(hù)，C組則是模仿臨床的傳統(tǒng)方法，臨床治療中總是在術(shù)后第1d早上若發(fā)現(xiàn)有問題才進(jìn)行處理，我們認(rèn)為這種做法可能錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)。本研究發(fā)現(xiàn)，A組由于用藥時(shí)間早，可能使大量臨界細(xì)胞順利完成了自身修復(fù)，得以存活，所以僅在造模后第1d早上角膜有1級(jí)水腫，角膜厚度沒有明顯增加；而C組在造模后第1d早上角膜水腫嚴(yán)重，此后開始使用高滲液，角膜厚度變薄，但是，也許由于細(xì)胞負(fù)擔(dān)過重，導(dǎo)致更多角膜內(nèi)皮細(xì)胞死亡，所以造模后1wk內(nèi)，盡管高滲液連續(xù)使用，但是角膜厚度基本均在400μm以上，造模后各觀察時(shí)間點(diǎn)A、C組兔眼角膜中央厚度差異顯著。1wk后，C組兔眼角膜透明，第一時(shí)間測量了角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)，C組的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯小于A組，這表明高滲液的延遲使用，導(dǎo)致了角膜內(nèi)皮細(xì)胞更多的死亡。B、D組作為對照組，未給予地塞米松注射液結(jié)膜下注射和高滲液滴眼，在整個(gè)觀察期間，B、D組角膜明顯水腫，角膜內(nèi)皮細(xì)胞無法計(jì)數(shù)。上述研究結(jié)果表明，地塞米松注射液聯(lián)合葡萄糖高滲液對兔眼角膜內(nèi)皮具有保護(hù)作用，提前用藥對于角膜內(nèi)皮的保護(hù)有著關(guān)鍵性的作用。本實(shí)驗(yàn)的觀察期僅為7d，主要是由于兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有增生能力，這與人眼不同，長于7d的觀察受增生的影響較大，不能模擬臨床問題。我們觀察發(fā)現(xiàn)，3wk后各組兔眼角膜均接近透明。

綜述所述，地塞米松注射液聯(lián)合葡萄糖高滲液對兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞有良好的保護(hù)作用，早期聯(lián)合應(yīng)用能有效預(yù)防及治療角膜水腫，避免進(jìn)展至角膜內(nèi)皮失代償。但本研究未比較單純使用地塞米松或葡萄糖高滲液的療效，需在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索。