G補綴FHA域血管生成因子1在糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用

李 蓉，姚國敏，閆紅林，王 莉，蔡天志，袁博博，巨 偉，王麗娜

0引言

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見的眼部微血管并發(fā)癥，也是成年人視力損害的主要原因，常導致視力下降、視野缺損、玻璃體積血，嚴重者甚至出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離，最終失明[1-2]。DR的主要病理改變包括晚期病理性視網(wǎng)膜新生血管生成，其機制受體內(nèi)多種血管生成相關因子的影響，繼發(fā)視網(wǎng)膜脫離和玻璃體積血等是患者視力喪失的主要因素[3]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，DR的患病率不斷升高，作為眼科常見的致盲性眼病，目前仍是眼科醫(yī)師的一個治療難題。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物治療視網(wǎng)膜新生血管顯示出一定程度的有效性，但抗VEGF藥物半衰期短，需頻繁眼內(nèi)玻璃體腔注射，故存在一定的風險[4]。因此，研究其他參與DR視網(wǎng)膜血管生成的因素對于闡明其病理機制和疾病治療具有重要意義。G補綴FHA域血管生成因子1(angiogenic factor with G patch and FHA domains 1，AGGF1)是Tian等[5]在對先天性靜脈畸形骨肥大綜合征(Klippel-Trenaunay syndrome,KTS)者的研究中新發(fā)現(xiàn)的一個具有多個特殊結(jié)構(gòu)域的新基因。AGGF1基因在人體組織器官(腦、眼、心臟等)和細胞中廣泛表達。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，AGGF1蛋白具有較強的促血管生成作用[5-8]。然而，目前尚無報道探究AGGF1與DR之間的關系?；诂F(xiàn)有的研究我們推測，AGGF1促進血管生成可能在DR的病理機制中發(fā)揮著不可忽視的作用。為了證實這一設想，本研究以DR動物模型及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞為研究對象，觀察AGGF1在DR相關病理條件下的表達情況及其對血管生成過程的影響。

1材料和方法

1.1材料C57BL/6J小鼠購自西安醫(yī)學院實驗動物中心；鏈尿佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；Dako REAL EnVision Detection System購自丹麥Dako公司；AGGF1抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；恒河猴脈絡膜/視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(RF/6A細胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司；DAPI、Triton X-100購自碧云天生物技術有限公司；濃縮型正常山羊血清、熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司；人AGGF1重組蛋白購自美國Abnova公司；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠均購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1 DR動物模型建立本研究中的動物實驗獲得了西安醫(yī)學院倫理委員會的批準，并根據(jù)眼科和視力研究動物使用聲明(ARVO)進行。取SPF級8周齡的健康雄性C57BL/6J小鼠，適應性飼養(yǎng)1wk。動物房12h/12h晝夜交替，溫度23℃～25℃，保持小鼠自由飲水、進食。將12只小鼠隨機分成對照組和DR組，各6只。正常組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，糖尿病組小鼠造模方法為禁食24h后，精確稱量體質(zhì)量，按照100mg/kg的劑量予一次性腹腔注射1% STZ溶液(模型組)或0.1mol/L檸檬酸緩沖液(對照組)。普通飲食，勤加水，勤換墊料。注射72h后，剪掉尾部尖端少許，用血糖儀測量血糖，血糖高于16.7mmol/L視為造模成功。

1.2.2免疫組化法檢測視網(wǎng)膜AGGF1的表達取小鼠眼球依次經(jīng)過脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，烤片，脫蠟，抗原修復等步驟制作石蠟切片，經(jīng)過阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，AGGF1一抗(1∶100)孵育，然后根據(jù)顯色試劑盒Dako REALTMEn Vision DetectionTMSystem(Peroxidase/DAB+, K5007)說明書進行后續(xù)免疫組化染色，最后進行HE復染，脫水，封片。顯微鏡下拍照，觀察AGGF1在視網(wǎng)膜中的表達和分布，使用IPP6.0軟件對免疫熒光照片進行光密度分析。

1.2.3細胞培養(yǎng)及分組解凍、離心RF/6A細胞，用1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)懸浮細胞，接種到培養(yǎng)皿中吹打混勻，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細胞的密度達到80%時，對細胞按1∶3進行傳代。將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化后，用培養(yǎng)基制備單細胞懸液，按照每孔5×105個將細胞均勻的接種到6孔板中，37℃、5% CO2飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。首先，將RF/6A細胞分為對照組、高糖組(培養(yǎng)基中加入25mmol/L D-葡萄糖溶液)，培養(yǎng)24h，免疫熒光法觀察細胞中AGGF1的蛋白表達。其次，將RF/6A細胞分為對照組、AGGF1處理組(培養(yǎng)基中加入0.5μg/mL AGGF1)，分別采用CCK-8、Transwell和Matrigel檢測細胞增殖、遷移及管腔形成。

1.2.4免疫熒光法檢測細胞AGGF1的表達PBS浸洗已爬好細胞的玻片，4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，0.5% Triton X-100室溫通透20min，PBS浸洗玻片3次，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；吸水紙吸掉封閉液，每張玻片滴加足夠量的稀釋的AGGF1一抗(1∶100)并放入濕盒，4℃孵育過夜，PBST 浸洗爬片3次，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的二抗熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG(1∶100)，濕盒中37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI，吸水紙吸干爬片上的液體，封片后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，IPP6.0軟件對照片進行光密度分析。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化離心后，配制成5×104個/mL的單細胞懸液，按每孔100μL接種于96孔板，同時設置空白孔，周圍孔加入100μL PBS，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。根據(jù)實驗分組處理12、24、48h，按CCK-8試劑盒操作說明進行細胞增殖檢測，用自動酶標儀(德國eppendorf公司)檢測450nm波長吸光度值(A)。細胞增殖率(%)=(A實驗組-A空白孔)/(A空白對照組-A空白孔)×100%。

1.2.6 Transwell小室檢測細胞遷移用1640培養(yǎng)基重懸細胞，將不同處理組培養(yǎng)12h的RF/6A細胞密度調(diào)整為2×105/mL，取200μL細胞懸液置于Transwell上室，使其朝著下室遷移。37℃，5% CO2條件下孵育48h，Transwell膜底部的細胞在37°C條件下用70%冰乙醇溶液固定1h，0.5%結(jié)晶紫染液染色20min。PBS漂洗膜3次后在顯微鏡下拍照，在3個標準視野下計數(shù)遷移細胞。

1.2.7 Matrigel檢測細胞管腔形成按Matrigel說明書進行操作。4℃融化Matrigel過夜，取24孔板，每孔內(nèi)緩慢加入200μL液態(tài)Matrigel，此操作在冰上進行。消化細胞后，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋不同處理組培養(yǎng)12h的細胞，計數(shù)后按照每孔2×105個將各組細胞接種至預鋪有基質(zhì)膠的24孔板，37℃過夜培養(yǎng)。顯微鏡拍照，隨機取3個放大100倍的視野(×100)照相，采用Image J軟件計算管腔數(shù)和分支長度，取平均值。

2結(jié)果

2.1 DR的視網(wǎng)膜中AGGF1表達增強免疫組化結(jié)果顯示，AGGF1蛋白在視網(wǎng)膜各層均有表達，在血管內(nèi)皮細胞中也有明顯表達。AGGF1在DR組視網(wǎng)膜中的表達明顯強于對照組，兩組的平均光密度分別為(0.17±0.05)和(0.07±0.02)，組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=-2.89，P<0.05,圖1)。

圖1 免疫組化染色觀察各組視網(wǎng)膜中AGGF1的分布與表達(×200) 兩組視網(wǎng)膜各層均可見AGGF1表達(棕色)，與對照組相比，DR組中表達更強。aP<0.05 vs對照組。

2.2高糖條件下的RF/6A細胞表達AGGF1增強免疫熒光結(jié)果顯示，AGGF1蛋白在高糖組和對照組RF/6A細胞中均有表達。AGGF1在高糖下RF/6A細胞中的表達明顯強于對照組，兩組的平均光密度分別為0.63±0.10、0.40±0.03，組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=-3.87，P<0.05，圖2)。

圖2 免疫熒光法觀察各組RF/6A細胞中AGGF1的表達(×200) 兩組RF/6A細胞中均可見AGGF1表達(紅色)，與對照組相比，高糖組中表達更強。aP<0.05 vs對照組。

2.3 AGGF1促進RF/6A細胞增殖CCK-8實驗結(jié)果顯示，對照組處理12、24、48h的細胞增殖率分別為100.00%±2.17%、142.77%±0.50%、160.17%±1.33%；AGGF1組處理12、24、48h的細胞增殖率分別為114.88%±0.84%、157.35%±1.89%、185.39%±1.90%。重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，各時間點的組間存在差異，各組間的時間點存在差異(F時間=7799.16，P時間<0.01；F組間=1033.00，P組間=0.001；F時間×組間=83.65，P時間×組間=0.001)。進一步采用獨立樣本t檢驗比較各時間點的組間差異，結(jié)果顯示各時間點AGGF1組的細胞增殖率均明顯大于對照組(12h：t=-30.72，P<0.01；24h：t=-12.92，P<0.01；48h：t=-18.85，P<0.01)。進一步LSD-t檢驗進行各組的時間差異比較，結(jié)果顯示各組不同時間點的差異均具有統(tǒng)計學意義，對照組24h的細胞增殖率大于12h的增殖率(P<0.01)，48h細胞增殖率大于12、24h的增殖率(均P<0.01)；AGGF1組24h的細胞增殖率大于12h的增殖率(P<0.01)，48h細胞增殖率大于12、24h的增殖率(均P<0.01)，見圖3。結(jié)果提示，隨著處理時間的延長，兩組細胞增殖率均逐漸增加，在各時間點，AGGF1處理組的細胞增殖均強于對照組。

圖3 CCK-8法檢測各組RF/6A細胞的增殖(×100) 與對照組相比，AGGF1組RF/6A細胞增殖更強。aP<0.05 vs對照組。

2.4 AGGF1促進RF/6A細胞遷移本部分實驗觀察了AGGF1處理12h的RF/6A細胞遷移情況。Transwell實驗結(jié)果顯示，AGGF1組細胞遷移數(shù)(127.00±7.00個)明顯多于對照組(90.33±6.66個)，組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=-6.57，P<0.05，圖4)。結(jié)果提示，AGGF1對RF/6A細胞遷移具有明顯的促進作用。

圖4 Transwell法觀察各組RF/6A細胞的遷移(×200) 與對照組相比，AGGF1組RF/6A細胞遷移數(shù)更多。aP<0.05 vs對照組。

2.5 AGGF1促進RF/6A細胞管腔形成本部分實驗觀察了AGGF1處理12h的RF/6A細胞管腔形成情況。Matrigel實驗結(jié)果顯示，AGGF1組細胞管腔數(shù)(33.67±1.15個)明顯多于對照組(15.33±3.51個)，組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=-8.59，P<0.05)；AGGF1組細胞分支總長度(8226.33±288.55μm)明顯多于對照組(6463.33±938.01μm)，組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=-3.11，P<0.05)，見圖5。結(jié)果提示，AGGF1對RF/6A細胞的管腔形成具有明顯的促進作用。

圖5 Matrigel法觀察各組RF/6A細胞的管腔形成(×100) 與對照組相比，AGGF1組RF/6A細胞管腔形成數(shù)更多，aP<0.05 vs對照組。

3討論

新生血管是由既存的成熟血管的內(nèi)皮細胞發(fā)生增殖、遷移，逐漸重構(gòu)形成新的小血管的一個多步驟的復雜過程[9]。血管生成是維持機體需要的基本生理過程，生理條件下促進血管生成和抑制血管生成的因子處于動態(tài)平衡，病理條件下，當促新生血管因子增加和/或抑新生血管因子減少時，出現(xiàn)異常的新生血管則會導致一些疾病的發(fā)生，如創(chuàng)傷、腫瘤、糖尿病、風濕系統(tǒng)疾病、骨關節(jié)炎以及其他缺血性疾病等，而抑制血管生成可延緩和抑制疾病的進展[10]。糖尿病血管生成是糖尿病基本的病理過程，多種因子參與其中。血管生成受體內(nèi)促血管生成因子和血管生成抑制劑兩者的雙重調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)過程較為復雜。促血管生成因子主要有VEGF家族、血管生成素家族、堿性成纖維細胞生長因子家族。血管生成抑制劑主要有血管抑素、內(nèi)皮抑素、轉(zhuǎn)化生長因子β、組織金屬蛋白酶抑制劑等[11]。葡萄糖利用多種多樣的代謝途徑進行加工，慢性高血糖可引起多種細胞變化，導致并發(fā)癥的發(fā)生，因此糖尿病的持續(xù)時間和高血糖的嚴重程度是視網(wǎng)膜病變發(fā)生的主要危險因素[12]。小鼠STZ糖尿病模型[13]及高糖處理的內(nèi)皮細胞RF/6A[14]分別是用于研究DR病理機制及防治策略的常用動物和細胞模型，參照文獻方法，本研究利用DR小鼠視網(wǎng)膜和高糖條件下的RF/6A細胞作為觀察對象，較好地模擬了DR的病理環(huán)境，實驗結(jié)果為在體內(nèi)研究DR的治療靶點提供了可靠的依據(jù)。

AGGF1又名VG5Q，是2004年發(fā)現(xiàn)的參與血管生成的新基因。在KTS患者的基因組發(fā)現(xiàn)，5號染色體和11號染色體之間發(fā)生了一個斷點異位(5;11)(q13.3;p15.1)，這個變化和疾病相關。近一步研究在5號染色體13區(qū)3帶(5q13.3)斷點中發(fā)現(xiàn)了新基因AGGF1[5]。該基因全長34kb，有14個外顯子，編碼714個氨基酸，所表達蛋白相對分子量81kD。AGGF1的C端含有兩個功能保守結(jié)構(gòu)域：FHA(forkhead-associated)和G-patched結(jié)構(gòu)域；其N端含有coiled-coil結(jié)構(gòu)域。在原核生物和真核生物中的200多種蛋白質(zhì)中都存在FHA結(jié)構(gòu)域，參與包括細胞核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄、蛋白轉(zhuǎn)運、DNA修復和蛋白降解等過程[15]。在一些RNA結(jié)合蛋白或具有RNA結(jié)合功能的蛋白中都存在G-patched區(qū)域[16]。AGGF1基因在人體組織中呈現(xiàn)廣泛表達模式，其基因和蛋白在人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人微血管內(nèi)皮細胞中都有表達，提示AGGF1與血管形成存在關聯(lián)[5]。不過，AGGF1是否也表達于視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、是否與視網(wǎng)膜血管生成有關尚未見報道。鑒于此，本研究同時觀察了小鼠視網(wǎng)膜和RF/6A細胞中的AGGF1蛋白表達情況，證實AGGF1視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中均有表達。在高糖的刺激下，小鼠視網(wǎng)膜及RF/6A細胞表達AGGF1蛋白明顯增多，提示其可能參與了DR的病理過程。

Tian等[5]將純化的AGGF1蛋白注射到雞胚中，發(fā)現(xiàn)AGGF1蛋白可與內(nèi)皮細胞結(jié)合，激發(fā)內(nèi)皮細胞的增殖并促進血管生成，且增加的血管數(shù)量遠高于VEGF帶來的效果。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)，敲除AGGF1基因可導致斑馬魚胚胎血管發(fā)育出現(xiàn)缺陷，且一系列內(nèi)皮細胞特異表達基因的表達量明顯降低；而過量表達AGGF1則導致體節(jié)間血管過度出芽，并促進絲狀偽足形成，體內(nèi)AGGF1表達量升高也使內(nèi)皮細胞特異基因表達上調(diào)。AGGF1敲除阻礙斑馬魚靜脈血管形成，而過量表達可增加靜脈血管直徑。近年來腫瘤方面的研究提示AGGF1在惡性腫瘤中呈現(xiàn)過表達，發(fā)揮促進癌細胞浸潤、遷移以及腫瘤血管生成的作用，AGGF1高表達可以預測癌癥的不良預后[17-18]。以上研究結(jié)果均直接證明AGGF1具有強烈的促血管新生功能，但AGGF1在視網(wǎng)膜中是否也具有類似功能還缺乏報道。本研究在證實視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞可以表達AGGF1蛋白的基礎上，進一步觀察了AGGF1對RF/6A細胞的增殖、遷移和管腔形成的影響，發(fā)現(xiàn)AGGF1可明顯促進這些血管生成過程。目前關于AGGF1促血管生成的機制研究較少，認為雖然其效應類似于VEGF，但與VEGF信號通路無關[5,8]。Tian等[5]以AGGF1為誘餌進行酵母雙雜交實驗，發(fā)現(xiàn)AGGF1可直接與腫瘤壞死因子家族成員之一 TWEAK因子直接相互作用，使TWEAK與其受體fibroblast-growth-factor-inducible 14(Fnl4)結(jié)合形成三聚體介導血管生成。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)，AGGF1可正調(diào)控體內(nèi)AKT的活性，在體內(nèi)過量表達持續(xù)性活性AKT可挽救AGGF1表達下降引起的血管發(fā)育缺陷。另外一些研究認為，AGGF1的促血管生成功能與其調(diào)控AKT,PI3K,ERK1/2信號通路以及抑制血管炎癥有關[5-6,19-20]。然而，AGGF1以何種機制參與了DR的視網(wǎng)膜血管生成還需要進一步研究。

有關AGGF1的應用方面，Lu等[7]發(fā)現(xiàn)注射到單側(cè)下肢缺血小鼠腓腸肌的真核表達質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)錄生成AGGF1 mRNA并翻譯生成AGGF1蛋白，AGGF1的高表達可增加缺血后肢的血流流速，抑制缺血引起的組織壞死，加速缺血的腓腸肌的血管新生。在心血管疾病方面，缺氧后小鼠心臟內(nèi)皮細胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的AGGF1 mRNA和蛋白表達增加。急性心肌梗死后，小鼠心肌組織AGGF1的mRNA和蛋白表達增加。AGGF1可促進血管生成，抑制心肌細胞凋亡。靜脈注射純化的重組AGGF1蛋白治療急性心肌梗死可以明顯降低小鼠死亡率，并顯著提高其心臟功能[8]。上述這些研究結(jié)果提示，AGGF1在針對缺血性疾病的治療方面具有很好的應用前景。持續(xù)性高血糖是DR發(fā)展的主要刺激因素[21]，而局部缺血、缺氧是形成視網(wǎng)膜新生血管形成的先決條件[22]。雖然本研究提示AGGF1可能與DR的病理機制相關，而AGGF1具有直接促進血管形成的效應，但AGGF1在DR疾病不同時期中的作用還不清楚。結(jié)合文獻和本研究結(jié)果我們推測，一方面在視網(wǎng)膜缺血缺氧前給予AGGF1治療，可通過促血管生成減小視網(wǎng)膜無灌注區(qū)，進而間接減小視網(wǎng)膜新生血管形成的風險；另一方面，在視網(wǎng)膜新生血管形成期將AGGF1作為重要靶點進行干預，可能直接減少病理性視網(wǎng)膜新生血管形成?？傊狙芯拷沂続GGF1在糖尿病視網(wǎng)膜血管生成方面具有重要調(diào)節(jié)作用，本結(jié)果將有助于為DR機制的深入研究以及血管靶向藥物的進一步研發(fā)提供新思路。