PDE-4 抑制劑對氯胺酮導致幼年大鼠學習記憶障礙的改善作用

冀會娟，畢彥博，孟慧芳，李鵬超，樊青，胡振華

（1.河南中醫(yī)藥大學附屬鄭州人民醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州450002；2.河南省人民醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州450005）

氯胺酮是肌肉松弛等小手術常用麻醉藥物之一，具有誘導快，鎮(zhèn)痛效果優(yōu)良，患者蘇醒快，呼吸系統(tǒng)抑制作用小等優(yōu)勢[1]。 但動物實驗顯示，氯胺酮可導致幼年大鼠短期、 遠期學習記憶能力下降[2,3]。 磷酸二酯酶-4（Phosphodiesterase-4，PDE-4）抑制劑是一種具有抗炎效應的藥物,目前常用的PDE-4 抑制劑有Ro20-1724、羅氟司特和西洛司特等。臨床研究表明[4]，PDE-4 抑制劑對氯胺酮引發(fā)的學習記憶障礙具有顯著療效。 海馬區(qū)是人學習、記憶的重要腦組織,該區(qū)域內(nèi)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白是cAMP/PKA-CREB-BDNF 信號通路的重要介質(zhì)，與人學習、記憶功能密切相關。 為探討PDE-4抑制劑對氯胺酮導致幼年大鼠學習記憶障礙的實際療效及對大鼠海馬區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 表達水平的影響,本組研究選取21d 40 只SD 大鼠進行研究。 報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選取21d SD 大鼠40 只，雌雄各半，購自中科院上海實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)一周，室內(nèi)溫度22～26℃，濕度50～60%，自由攝食及飲水，晝夜各12h，隨機分為對照組，氯胺酮組，氯胺酮+PDE-4 抑制劑組，氯胺酮+PDE-4 抑制劑溶媒組，各組10 只后分籠飼養(yǎng)。兔抗鼠p-CREB抗體、 兔抗鼠EGFR 抗體以及兔抗大鼠BDNF 抗體由武漢伊艾博科技有限公司提供;氯胺酮由浙江九旭藥業(yè)有限公司提供；PDE-4 抑制劑Ro20-1724 由美國Sig-ma 公司提供；羊抗兔IgG 由北京莊盟國際生物基因科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 干預措施 對照組大鼠給予2ml 生理鹽水腹腔注射，30min 后再次注射2ml 生理鹽水; 氯胺酮組大鼠給予腹腔注射65mg/kg 氯胺酮（浙江九旭藥業(yè)有限公司，國藥準字：H20023609），30min 后注射2ml 生理鹽水; 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組大鼠給予同上氯胺酮注射，30min 后腹腔注入0.5mg/kg Ro 20-1724(美國Sig-ma 公司,進準字：070M1976V)；氯胺酮+PDE-4 抑制劑溶媒組大鼠給予同上氯胺酮注射，3min 后腹腔注射2ml 0.1%乙醇（Ro20-17 24 溶媒），隨后給予所有大鼠正常喂養(yǎng)7~8d。

1.2.2 Morris 水迷宮測試 各組大鼠Morris 水迷宮實驗：于160cm 直徑,75cm 高度的圓形水池內(nèi)進行實驗，水深50cm，水溫約為25℃，滴入墨水染色，將水池分為4 個象限， 于第一象限放置一個低于水面2cm 的面積6×8cm 的長方形平臺。 于給藥9d后每天8:00 按1~4 象限順序?qū)⒋笫蠓湃胨?，記?20s 內(nèi)大鼠從各入水點爬到平臺的時間， 并將其判定為逃避潛伏期。如大鼠于120s 內(nèi)找到平臺，則讓大鼠于平臺上留置30s，記錄相應的逃避潛伏期；如大鼠未找到平臺，則引導其尋找平臺，讓大鼠于平臺上留置30s， 并將其逃避潛伏期記錄為120s。 連續(xù)實驗5d，于第6d 撤去平臺，同前入水實驗，記錄120s 大鼠穿過平臺原位置的次數(shù)。

1.2.3 Western blot 檢測 Morris 水迷宮實驗結(jié)束后脫頸處死大鼠，打開顱腦取出海馬組織，選用細胞裂解液提取海馬組織蛋白, 選用BCA 法進行蛋白定量,并電泳轉(zhuǎn)膜，10ml 脫脂奶室溫下封閉60min，分別選用兔抗鼠p-CREB 抗體(l：500)、兔抗鼠EG FR 抗體(1：1000)以及兔抗大鼠BDNF 抗體(l：1500)進行一抗,搖床孵化60min，選用酶標羊抗兔IgG（1:2000）進行二抗，孵化60min，曝光成像，選用美國Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS19.0 軟件，計量資料采用（±s)表示，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組第2d、 第3d 和第4d 逃避潛伏期明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組(P＜0.05),與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 見表1。

2.2 各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較 氯胺酮+PDE-4抑制劑組穿越平臺次數(shù)明顯高于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組（P＜0.05），與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF水平比較 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白相對表達量分別為0.761±0.100、0.370±0.081 和0.418±0.092,明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組(P＜0.05),與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 見表3、圖1。

3 討論

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（s）

表2 各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較

表3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 水平比較

圖1 Western blot 檢測圖

磷酸二酯酶(phosphodiesteras，PDEs)具有促環(huán)磷酸腺苷或環(huán)磷酸鳥苷等細胞第二信使水解功能，并以此終止第二信使介導的生化反應[5]。PDE-4抑制劑則可抑制PDEs 活性，并增強環(huán)磷酸腺苷或環(huán)磷酸鳥苷表達[6]。PDE-4 抑制劑具有多種效應,如抗炎,其可抑制Th2 生成IL-4、IL-5 等炎癥介質(zhì),抑制細胞粘附因子表達。 PDE-4 抑制劑還可誘導細胞凋亡, 促進內(nèi)源性激素及兒茶酚胺類物質(zhì)表達[7,8]。Ro20-1724 是新型PDE-4 抑制劑，本品可改善睡眠障礙, 并可改善鏈脲霉素及3-硝基丙酸引發(fā)的大鼠認知功能障礙,其機制可能與現(xiàn)cAMP/PKA-CREB-BDNF 信號通路有關[9]。但對于Ro20-1724是否可改善氯胺酮引發(fā)的幼兒認知功能障礙癥狀及其機制，臨床研究較少,為此，我們進行了本組研究。

本組研究發(fā)現(xiàn), 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組第2d、第3d 和第4d 逃避潛伏期明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；并且氯胺酮+PDE-4 抑制劑組穿越平臺次數(shù)明顯高于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，表面氯胺酮注射可引發(fā)大鼠學習、記憶功能障礙，而給予提示PDE-4 抑制劑治療后，大鼠學習、記憶障礙可得到有效恢復。 由于Ro20-1724 無法被水溶解，為此本組研究選用乙醇作為助溶劑[10]。 需要注意的是, 高劑量的乙醇給藥也可能引發(fā)腦組織學習、記憶障礙，因此本組研究將乙醇配置成1%濃度。

人腦學習、記憶等高級神經(jīng)活動主要通過海馬區(qū)實現(xiàn)，當大腦皮質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)元接受到視覺、觸覺等感覺信息時,神經(jīng)元會將這些信息傳遞至海馬區(qū)[11]。如海馬區(qū)存在反應，神經(jīng)元將因此形成網(wǎng)絡，并存儲（記憶）/刪除（遺忘）某些信息。 EGFR 是表皮生長因子受體的一種，廣泛存在于上皮、膠質(zhì)以及成纖維細胞內(nèi)。 EGFR 介導的信號路徑與細胞生長、增殖以及分化密切相關[12]。 CREB 是一種具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力的蛋白質(zhì),當環(huán)磷腺苷活化并誘導PKA 轉(zhuǎn)入細胞核后，CREB 將被活化，并調(diào)控靶向基因表達。BDNF 是腦組織內(nèi)生成的一種蛋白質(zhì)，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是神經(jīng)元分化、生長以及存活的重要介質(zhì)[13]。 臨床研究顯示，海馬區(qū)記憶形成依賴于CREB 誘導下游BDNF 基因活化[14]。 本組研究中，氯胺酮+PDE-4 抑制劑組海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白相對表達量明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義, 提示PDE-4 抑制劑可通過抑制PDEs 活性， 增強神經(jīng)元細胞環(huán)磷腺苷表達，并激活PKA，活化CREB，最終作用BDNF 表達，激活整個cAMP/PKA-CREB-BDNF 信號通路， 逆轉(zhuǎn)氯胺酮引發(fā)的大鼠學習、記憶障礙[15]。

綜上所述，PDE-4 抑制劑可改善氯胺酮導致的幼年大鼠學習記憶障礙,可能與其影響大鼠海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白表達有關,PDE-4 抑制劑Ro20-1724 或可用于治療氯胺酮等麻醉藥物引發(fā)的學習、記憶障礙。