Streptomyces sp.N2所產(chǎn)農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉的拮抗活性及作用機(jī)制研究

劉 群，王麗華，陳東海，彭偉建，徐家興，李昆太*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045；2.江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，江西 南昌 330029）

【研究意義】桔青霉（Penicillium citrinum）是一種杯霉科真菌，常見(jiàn)于腐爛的水果、蔬菜、木材、肉類、皮革上，多成灰綠色，能夠引起木材的腐霉病[1]。我國(guó)木材資源相對(duì)匱乏，木材再生周期較長(zhǎng)，隨著天然林保護(hù)工程的實(shí)施，木材產(chǎn)量難以滿足市場(chǎng)需求，目前，在國(guó)內(nèi)外木材防霉防腐研究中，常用處理方法有物理法、化學(xué)法和微生物法[2]，物理方法為煙熏、蒸煮及高溫?zé)崽幚淼?；化學(xué)方法為使用有機(jī)碘化物、三唑化合物、硼化物和銅基類防霉劑[3]。【前人研究進(jìn)展】Sharma等[4]研究了放線菌（Streptomyces exfoliatusMT9）分離物對(duì)木材腐爛真菌的體外拮抗作用，發(fā)現(xiàn)MT9對(duì)多種木腐菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗真菌活性。Anand等[5]發(fā)現(xiàn)紫色鏈霉菌（Streptomyces violaceusniger）深層發(fā)酵產(chǎn)生的溶瘤酶對(duì)木材白腐病和褐腐病菌都表現(xiàn)出廣泛的抗真菌活性。防霉防腐劑一般情況下都會(huì)對(duì)人體造成不良影響，對(duì)環(huán)境有污染，因此采取何種措施提高性能，提高殺菌劑耐久性，降低自身毒性是研究的重點(diǎn)[6]。尋求安全、無(wú)毒、有效的拮抗微生物制劑來(lái)取代化學(xué)藥劑是當(dāng)今的一個(gè)重點(diǎn)研究方向[7]。相比于化學(xué)防治，生物防治具有安全、無(wú)毒和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。用于植物病原真菌生物防治的微生物主要有木霉屬（Trichodermaspp.）、粘帚霉屬（Gliocladiumspp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）和鏈霉菌屬（Streptomycesspp.）[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】其中，鏈霉菌（Streptomycesspp.）是已知放線菌中最大的簇群，可產(chǎn)生豐富多樣的抗菌活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于真菌病害生防[9]。Streptomycessp.N2是本課題組Xu等[10]分離篩選到的一株可產(chǎn)新型抗真菌活性物質(zhì)（3-甲基-3，5-氨基-4-烯-吡喃-2-酮，分子式為C6H7O2N，農(nóng)抗N2）的新種，此活性物質(zhì)對(duì)桔青霉具有良好的拮抗效果?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文從生長(zhǎng)特征、宏觀形態(tài)特征和微觀形態(tài)特征等角度初步研究了農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉的拮抗作用效果，以期為進(jìn)一步探討Streptomycessp.N2對(duì)桔青霉的拮抗機(jī)理及其生防應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鏈霉菌N2（Streptomycessp.N2）由本實(shí)驗(yàn)室自行分離篩選獲得，甘油管凍存保藏。桔青霉（Penicillium citrinum）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 農(nóng)抗N2粗提物的制備

參照吳志明等[11]將培養(yǎng)7 d 的鏈霉菌N2 孢子刮入30 mL 帶玻璃珠的無(wú)菌蒸餾水中，震蕩20 min 后，將5 mL 孢子懸液移入裝有50 mL 種子培養(yǎng)液（蔗糖20 g，玉米淀粉10 g，玉米漿10 g，硫酸銨1 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂1 g，硫酸錳0.01 g，硫酸鋅0.01 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4）的250 mL三角瓶中，160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h即得鏈霉菌N2種子液。

種子液按10%接種量接入發(fā)酵液培養(yǎng)基（蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米漿20 g，黃豆餅粉10 g，硫酸銨2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂1 g，硫酸錳0.01 g，硫酸鋅0.01 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min）中，160 r/min、30 ℃培養(yǎng)96 h，收集發(fā)酵液。參照楊勇等[12]提取方法，加入2 倍體積工業(yè)酒精浸提至少24 h后4 000 r/min離心30 min棄除菌體，上清液經(jīng)減壓濃縮至酒精蒸干后于10 000 r/min離心10 min保留上清液，最后用0.22μm 濾膜過(guò)濾除菌即得無(wú)菌發(fā)酵液原液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋無(wú)菌發(fā)酵原液制成1.44，2.88，5.77，11.53，23.06μg/mL等不同質(zhì)量濃度農(nóng)抗N2藥液，備用。

1.3 農(nóng)抗N2粗提物抑菌作用分析

1.3.1 采用杯碟法[13]測(cè)定農(nóng)抗N2 對(duì)桔青霉的抗菌活性 用50 mL 無(wú)菌水將桔青霉制成菌懸液后，移取200μL 均勻涂布于PDA（去皮土豆200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2）培養(yǎng)基上，15 min 后小心放入牛津杯，加入200μL 不同濃度N2 粗提物。以無(wú)菌水CK 為對(duì)照，各處理重復(fù)3 次，72 h 后測(cè)定抑菌圈直徑并記錄。

1.3.2 采用曹等的方法[14]測(cè)定農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）將農(nóng)抗N2原液與冷卻至45 ℃的PDA 培養(yǎng)基混勻，制成終濃度分別為5.77，2.88，1.44，0.72μg/mL 的含藥平板后，將桔青霉菌懸液均勻涂布于藥平板表面，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h；以不含農(nóng)抗N2 的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理做5次重復(fù)，觀察記錄桔青霉生長(zhǎng)情況，以抑制桔青霉生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

1.3.3 采用菌絲干重法測(cè)定農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉生長(zhǎng)量的變化 將待測(cè)桔青霉接種1 mL于50 mL PD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)24 h后；加入適量鏈霉菌N2無(wú)菌發(fā)酵液原液使其終濃度達(dá)到3.84μg/mL，以加等量無(wú)菌蒸餾水培養(yǎng)作為對(duì)照，30 ℃，180 r/min 恒溫震蕩培養(yǎng)。每隔12 h 取樣3 個(gè)重復(fù)，用真空泵將培養(yǎng)基抽干，留取菌絲，并置于80 ℃烘箱中至恒質(zhì)量，觀察桔青霉菌絲在液體培養(yǎng)基中的形態(tài)變化，并稱量、記錄菌絲干質(zhì)量。

1.3.4 農(nóng)抗N2粗提物對(duì)桔青霉超微結(jié)構(gòu)的影響 將1 mL桔青霉菌懸液接種于50 mL PD液體培養(yǎng)基中。30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)72 h后，分別加入15 mL、50 mL鏈霉菌N2無(wú)菌發(fā)酵液原液，以加等量無(wú)菌蒸餾水培養(yǎng)作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)對(duì)照30 ℃、180 r/min 恒溫震蕩培養(yǎng)。于48 h后取樣，離心機(jī)10 000 r/min離心10 min。培養(yǎng)48 h后制備掃描電鏡和透射電鏡樣品。

掃描電鏡和透射電鏡樣品的加工按康振生[15]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉的抑菌作用

不同濃度農(nóng)抗N2作用下的桔青霉抑菌圈直徑如表1所示。由表1可以看出，隨著農(nóng)抗N2作用濃度的增加，其對(duì)桔青霉的抑制效果愈加強(qiáng)烈。當(dāng)農(nóng)抗N2作用濃度為11.53μg/mL 時(shí)，桔青霉抑菌圈直徑達(dá)到（18.66±1.94）mm。

表1 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉抑菌圈平均直徑Tab.1 The average diameter of the inhibition zone of Streptomyces sp.N2 against P.citrinum

2.2 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉生長(zhǎng)周期的影響

通過(guò)測(cè)定菌體的生長(zhǎng)曲線可以反映微生物對(duì)培養(yǎng)基成分的利用情況，以及藥物對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。桔青霉在3.84 μg/mL 農(nóng)抗N2 作用下的生長(zhǎng)情況如圖1 所示。由圖1 可知，當(dāng)PD 培養(yǎng)基中不添加農(nóng)抗N2，桔青霉在24 h 之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量顯著增加在第96 h時(shí)菌體干質(zhì)量達(dá)1.70 g；而在農(nóng)抗N2 作用下的桔青霉菌體數(shù)量明顯少于對(duì)照組，其最大菌體干質(zhì)量?jī)H為1.34 g，這說(shuō)明農(nóng)抗N2能夠有效抑制青霉細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖。

圖1 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉生長(zhǎng)周期的影響Fig.1 The effects of Streptomyces sp.N2 on growth cycle of P.citrinum

2.3 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉形態(tài)學(xué)的影響

2.3.1 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉平板菌落形態(tài)的影響根據(jù)觀察和記錄的結(jié)果（圖2）可知：隨著農(nóng)抗N2 處理濃度的升高，桔青霉的抑制作用逐漸增強(qiáng)，菌落緊實(shí)且直徑明顯偏小，菌落呈白色且未經(jīng)色澤的變化，尤其是在添加5.77μg/mL 農(nóng)抗N2的平板上桔青霉完全未生長(zhǎng)；而對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)較快，菌落整體疏松有明顯的絨毛，而且菌落色澤由開(kāi)始的白色逐漸變成灰綠色、黃綠色。

圖2 農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉平板菌落形態(tài)的影響Fig.2 The effect of Streptomyces sp.N2 on colony morphology of P.citrinum

2.3.2 桔青霉掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察結(jié)果 掃描電子顯微鏡觀察對(duì)比發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組桔青霉菌菌絲粗壯均勻，較為光滑，形狀完整，飽滿圓潤(rùn)（如圖3、4）；經(jīng)低濃度農(nóng)抗N2（3.84μg/mL）處理的菌絲較稀疏，干癟變形，布滿褶皺（如圖3b，3e所示）；而經(jīng)較高濃度農(nóng)抗N2（5.32μg/mL）處理的菌絲更為干癟褶皺，表面更為粗糙，失水畸形，有明顯的胞內(nèi)物質(zhì)泄露（如圖3c，3f）。

2.3.3 桔青霉透射電子顯微鏡形態(tài)觀察結(jié)果 觀察透射電子顯微鏡圖片發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)農(nóng)抗N2處理的桔青霉細(xì)胞，細(xì)胞核核膜清晰，形狀規(guī)則完整，細(xì)胞膜以及細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，分布有序，線粒體均勻，細(xì)胞內(nèi)含物無(wú)外滲現(xiàn)象（如圖4a，4d）；經(jīng)低濃度農(nóng)抗N2（3.84μg/mL）粗提物處理的菌絲，細(xì)胞膜輪廓不清，細(xì)胞內(nèi)容物有輕微外滲，細(xì)胞器有所損傷，有空泡化，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)密度降低，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)囊泡，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)無(wú)序化（如圖4b，4e）；在高濃度農(nóng)抗N2（5.32μg/mL）處理下，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞器未能明顯觀察，處于降解狀態(tài)，菌體發(fā)生明顯的質(zhì)壁分離，胞內(nèi)出現(xiàn)大量空腔，細(xì)胞內(nèi)含物大量外滲，細(xì)胞核受到顯著破壞，輪廓模糊不清，400 000×高倍鏡下觀察明顯發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)密度顯著低于對(duì)照組（如圖4c，4f）。

圖3 桔青霉掃描電鏡形態(tài)觀察Fig.3 Morphological observation of P.citrinum under scanning electron microscope

圖4 桔青霉透射電鏡形態(tài)觀察Fig.4 Morphological observation of P.citrinum under transmission electron microscope

3 結(jié)論與討論

真菌病害是影響農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和植物病害的重要制約因素[16]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因植物病害而造成的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量下降比例就高達(dá)10%～16%[17]，而其中約70%～80%的植物病害是由病原真菌侵染所致[18-19]。袁敏等[20]通過(guò)研究表明鏈霉菌NG-715 所產(chǎn)抗真菌組分對(duì)桔青霉具有良好的抑制作用；李漢廣等[21]研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌702所產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)對(duì)桔青霉的抑菌活性良好。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Streptomycessp.N2 所產(chǎn)抗真菌代謝物農(nóng)抗N2 對(duì)桔青霉（P.citrinum）、意大利青霉（P.italicum）、指狀青霉（P.digitatum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棉花枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.vasinfectum）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）、萵苣菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）等多種植物病原真菌均具有較強(qiáng)抑菌活性，其中對(duì)桔青霉的抑制率高達(dá)85.49%[11]，由此說(shuō)明農(nóng)抗N2 具備廣譜的拮抗植物菌病原真菌特性，這為其在不同類型植物病害上的生防應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為本研究進(jìn)一步探討農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉的拮抗作用機(jī)理提供了有力根據(jù)。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，較系統(tǒng)的從生長(zhǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)學(xué)等角度，進(jìn)一步研究了農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉所引起的菌落形態(tài)及菌體細(xì)胞的一系列病變的防治效果。結(jié)果表明農(nóng)抗N2 對(duì)桔青霉的菌絲生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，且具有濃度效應(yīng)。桔青霉的抑菌圈直徑隨著農(nóng)抗N2 處理濃度的增大而增大，農(nóng)抗N2 對(duì)桔青霉的最低抑菌濃度為5.77μg/mL，其對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑為（13.04±1.06）mm。應(yīng)用電鏡技術(shù)就農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明農(nóng)抗N2對(duì)桔青霉的形態(tài)和結(jié)構(gòu)有很大的破壞作用，結(jié)合文獻(xiàn)[22]報(bào)道，可以推測(cè)農(nóng)抗N2 能夠影響桔青霉細(xì)胞壁相關(guān)蛋白的合成，使細(xì)胞壁的通透性增強(qiáng)，影響其細(xì)胞膜及內(nèi)部細(xì)胞器。本實(shí)驗(yàn)盡管初步探究了農(nóng)抗N2拮抗桔青霉的作用機(jī)理，但其對(duì)桔青霉具體作用位點(diǎn)以及其在自然環(huán)境中對(duì)木材的防腐效應(yīng)，工業(yè)產(chǎn)量等重點(diǎn)問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。