連作對廣藿香扦插苗土壤微生物及酶活性的影響

洪 彪，李 明，黃結雯，李敬輝，蔡 淼

（廣東藥科大學 中藥學院/國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006）

【研究意義】廣藿香Pogostemoncablin（blanco）benth.為唇形科刺蕊草屬植物，常用其地上干燥部分入藥，開胃止嘔，發(fā)表解暑[1]，具有抗菌抗病毒和對腸道調節(jié)的功能[2]。在生產中發(fā)現(xiàn)，廣藿香存在連作障礙，不僅嚴重影響產量，還對其品質有較大影響[3]?！厩叭搜芯窟M展】目前關于連作障礙[4]的原因主要歸納為以下3個方面：土壤生物學環(huán)境破壞、化感自毒作用和土壤理化性質惡化[5-8]。在土壤中進行的各種生理生化活動中，土壤酶活性占有重要地位[9-12]。吳鳳芝、李忠[14-15]研究表明隨著連作年限的增加，土壤中的脲酶、過氧化氫酶和轉化酶的活性顯著地降低，而多酚氧化酶的活性顯著升高。土壤細菌、真菌及放線菌種群的數(shù)量對于植物的生長、發(fā)育起到重要的影響。在對花生[15]、烤煙[17]連作的研究中發(fā)現(xiàn)，連作使根際土壤中的微生物種群比例失調，細菌和放線菌數(shù)量明顯降低，真菌數(shù)量升高，且土壤由細菌型向著真菌型轉變，從而導致植株易染病或死亡?！颈狙芯壳腥朦c】一些研究表明，連作導致根附近的代謝產物及植物組織腐解物對后茬作物產生的化感自毒作用，以及對土壤微生物的種群分布產生的間接影響，導致后茬生長的不利影響。本實驗室的前期研究[18-21]表明，廣藿香不同部位及根際土壤水浸液對其不定根的形成及其生長產生化感作用。【擬解決的關鍵問題】為了進一步研究連作對栽培廣藿香土壤的影響，將采用盆栽試驗，研究連作對廣藿香幼苗土壤酶活性和微生物區(qū)系的變化，探討廣藿香連作障礙與土壤酶活性和微生物變化的關系，旨為廣藿香連作障礙及緩解連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試廣藿香插穗、枯葉、重茬土和未種植過廣藿香的對照土均取自廣東藥科大學大學城藥圃（23°20′N，113°30′E，年降水量：1 623～1 900 mm，溫度：24～32 ℃）有機質含量43.09 g/kg、堿解氮含量162.49 mg/kg、有效磷含量47.80 mg/kg、速效鉀含量949.14 mg/kg、pH=7。

1.2 試驗方法

1.2.1 廣藿香枯葉腐解液的制備 參考吳燕燕[22]的方法制備不同質量濃度廣藿香枯葉腐解液：取廣藿香枯葉，置于室內自然風干，剪成2～3 cm 的小段后用粉碎機粉碎，過100 目篩收集粉末。分別稱取上述粉末適量，按1∶1∶10（枯葉∶土壤∶水）加入無菌水攪拌均勻，置于35 ℃恒溫恒濕箱中腐解30 d，先用脫脂棉濾除殘渣，再抽濾2 次，濾液為供試母液，質量濃度記為0.1 g/mL，置于冰箱4 ℃待用。取以上母液適量，經稀釋得到質量濃度為0.01，0.03，0.05，0.07 g/mL腐解液。

1.2.2 廣藿香扦插苗的培育 將已經扦插生根的2 周、8 周齡的廣藿香扦插苗移栽到土砂比例為9∶1的不同基質中。試驗共設6 個處理（對照土組、重茬土組、不同質量濃度枯葉腐解液組），每個處理重復3次，每組6株。每天定期定量澆灌10 mL腐解液或水。進行室內常溫培養(yǎng)。培養(yǎng)至20，40，60 d，每個處理組隨機取樣3盆檢測指標。

1.2.3 土壤微生物數(shù)量測定 參考劉素慧[23]的試驗方法，在超凈工作臺中，分別稱取土樣10 g，加入90 mL無菌水中，即為10-1稀釋的土壤懸浮液，置搖床上振動30 min，使土壤顆粒均勻分散，用蒸餾水稀釋到相應倍數(shù)。真菌為10-2和10-3，放線菌為10-4，細菌為10-5。每個質量濃度接種3 個重復，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。第3天進行真菌計數(shù)，第5天進行細菌計數(shù)，第10天進行放線菌計數(shù)。計數(shù)完畢后計算每克干土中的微生物數(shù)量。

細菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，成分：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0～7.2。

真菌培養(yǎng)基：馬丁氏培養(yǎng)基，成分：磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。每升培養(yǎng)基加1%孟加拉紅水溶液3.3 mL。臨用時，當培養(yǎng)基冷卻到40 ℃左右時，每培養(yǎng)基中加鏈霉素水溶液3.3 mL。

放線菌培養(yǎng)基：改良高氏一號培養(yǎng)基，成分：可溶性淀粉20 g，氯化鈉0.5 g，銷酸鉀1 g，磷酸氧二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，七水硫酸鐵0.01 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH7.2～7.4。臨用時在已融化的高氏號培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀溶液，以抑制細菌和霉菌生長。每30 mL培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1 mL（100 mg/kg）。

1.2.4 土壤酶活性測定 參考關松蔭[24]、李振高[25]的試驗方法。土壤脲酶活性的測定采用靛酚藍比色法，酶活性以24 h后1 g干土中NH3-N的質量表示，單位為mg/g；土壤酸性磷酸酶活性的測定采用磷酸苯二鈉比色法，酶活性以1 g干土的酚毫克數(shù)表示，單位為mg/g；土壤蔗糖酶活性的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，酶活性以24 h后1 g干土中葡萄糖的質量表示，單位為mg/g；土壤多酚氧化酶活性測定采用鄰苯三酚比色法，酶活性以2 h后1 g干土生成的紫色沒食子素毫克數(shù)表示，單位為mg/g；土壤過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法，酶活性以20 min后每克干土消耗的高錳酸鉀溶液的毫升數(shù)表示，單位mL/g。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013 和SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)處理。樣品間差異的顯著性檢驗（a=0.05）采用單因素方差分析（on-way ANOVA），并使用Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對根際土壤微生物數(shù)量的影響

本試驗結果表明，不同培養(yǎng)基質下培養(yǎng)的2周齡苗、8周齡苗根際土壤菌群數(shù)量均有所差異（表1、2）。2周齡苗、8周齡苗移栽到廣藿香重茬土壤上，在不同培育時期內，土壤細菌和放線菌數(shù)量較對照土顯著減少（P＜0.05），真菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05），在培育60 d時，2周齡苗根際土壤細菌和放線菌數(shù)量分別較對照土減少了34.39%、37.05%，根際土壤真菌數(shù)量分別較對照土增加了80.55%。8周齡苗根際土壤細菌和放線菌數(shù)量分別較對照土減少了73.10%、39.76%，真菌數(shù)量分別較對照土增加了56.91%。

表1 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對2周齡苗根際土壤微生物種群數(shù)量的影響Tab.1 Effects of continuous cropping soil and decomposed liquid of leaves on soil microbialpopulation of P.cablin of 2 weeks in its stem cuttings

表2 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對8周齡苗根際土壤微生物種群數(shù)量的影響Tab.2 Effects of continuous cropping soil and decomposed liquid of leaves on soil microbial population of P.cablin of 8 weeks in its stem cuttings

在廣藿香枯葉腐解液的培養(yǎng)基質中，在培育60 d 時，2 周齡苗、8 周齡苗根際土壤細菌和放線菌數(shù)量隨添加處理枯葉腐解液質量濃度的升高呈先升后降的變化，真菌數(shù)量隨添加處理液質量濃度的升高呈升高的變化。重茬土壤和相同質量濃度枯葉腐解液對2 周齡苗的根際土壤真菌數(shù)量影響比8 周齡苗根際土壤真菌數(shù)量大。且2 種苗齡的扦插苗根際土壤細菌和放線菌數(shù)量均隨培育時間的延長呈先增加后減少的趨勢，真菌數(shù)量呈不斷增長的趨勢。

2.2 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對扦插苗根際土壤酶活性的影響

2.2.1 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對扦插苗根際土壤脲酶活性的影響 本試驗結果表明，如圖1、2 所示，2 周、8 周齡苗廣藿香扦插苗培育在不同處理基質中，在培養(yǎng)期間，其脲酶活性較對照土均呈降低變化，較重茬土均呈升高變化（P＜0.05），且2種苗齡的扦插苗根際土壤脲酶活性均隨培育時間的延長呈先升后降的趨勢。2 周齡幼苗在不同處理組中脲酶活性在0～60 d 內出現(xiàn)先升后降的趨勢，在40 d 達到高峰。而8周齡苗在培育0～40 d內，土壤脲酶活性與對照土和重茬土相比顯著降低（P＜0.05），重茬土的脲酶活性較對照的顯著降低（P＜0.05）。比較而言，重茬土壤和枯葉腐解液對2 周齡苗的根際土壤脲酶活性影響比8周齡苗大。

圖1 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對2周齡苗根際土壤脲酶活性的影響Fig.1 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of urease in the rhizosphere soil of 2 weeks P.cablin in its stem cuttings

圖2 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對8周齡苗根際土壤脲酶活性的影響Fig.2 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of urease in the rhizosphere soil of 8 weeks P.cablin in its stem cuttings

2.2.2 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對扦插苗根際土壤酸性磷酸酶活性的影響 本試驗結果表明，如圖3、4所示，2周、8周齡苗廣藿香幼苗在0～60 d培養(yǎng)期間，其0.01，0.03，0.05 g/mL枯葉腐解液處理組酸性磷酸酶活性較重茬土均呈升高變化，較對照土呈降低變化（P＜0.05）。且土酸性磷酸壤酶活性均隨培育時間的延長呈先升后降的趨勢，而0.07 g/mL枯葉腐解液處理組在40～60 d較重茬土顯著降低（P＜0.05），重茬土的酸性磷酸酶活性較對照土的呈降低變化。比較而言，重茬土壤和相同質量濃度枯葉腐解液對2周齡苗的根際土壤酸性磷酸酶活性影響比8周齡苗大。

圖3 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對2周齡苗根際土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig.3 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of acid phosphatase in the rhizosphere soil of 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

圖4 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對8周齡苗根際土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig.4 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of acid phosphatase in the rhizosphere soil of 8 weeks P.cablin in its stem cutting

2.2.3 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對扦插苗根際土壤蔗糖酶活性的影響 本試驗結果表明，如圖5、6所示，2 周、8 周齡苗廣藿香扦插苗在0～60 d 培養(yǎng)期間，其0.01，0.03，0.05 g/mL 枯葉腐解液處理組蔗糖酶活性較重茬土均呈升高變化，較對照土呈降低變化（P＜0.05）。且土壤蔗糖酶活性均隨培育時間的延長呈先升后降的趨勢，而0.07 g/mL枯葉腐解液處理組在40～60 d較重茬土顯著降低（P＜0.05），重茬土的蔗糖酶活性較對照土的均呈降低變化。比較而言，重茬土壤和相同質量濃度枯葉腐解液對2周齡苗的根際土壤蔗糖酶活性影響比8周齡苗大。

2.2.4 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對扦插苗根際土壤多酚氧化酶活性的影響 本試驗結果表明，如圖7、8所示，2周、8周齡苗廣藿香扦插苗在0～60 d培養(yǎng)期間，其0.01，0.03，0.05 g/mL枯葉腐解液處理組多酚氧化酶活性較對照土的呈降低變化，較重茬土均呈升高變化（P＜0.05），在40 d達到高峰，且土壤多酚氧化酶活性均隨培育時間的延長呈先升后降的趨勢，而0.07 g/mL 枯葉腐解液處理組在60 d 較重茬土顯著降低（P＜0.05），重茬土的多酚氧化酶活性較對照呈降低變化。比較而言，重茬土壤和相同質量濃度枯葉腐解液對2周齡苗的根際土壤多酚氧化酶活性影響比8周齡苗大。

圖5 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對2周齡苗根際土壤蔗糖酶活性的影響Fig.5 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrationss on the activity of sucrase in the rhizosphere soil of 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

圖6 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對8周齡苗根際土壤蔗糖酶活性的影響Fig.6 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of sucrase in the rhizosphere soilof 8 weeks P.cablinin its stem cuttings

圖7 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對2周齡苗根際土壤多酚氧化酶活性的影響Fig.7 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of polyphenoloxidase in the rhizosphere soilof 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

圖8 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對8周齡苗根際土壤多酚氧化酶活性的影響Fig.8 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of polyphenoloxidase in the rhizosphere soil of 8 weeksP.cablinin its stem cuttings

2.2.5 廣藿香重茬土壤、枯葉腐解液對扦插苗根際土壤過氧化氫酶活性的影響 本試驗結果表明，如圖9、10 所示，2 周、8 周齡苗廣藿香扦插苗在0～60 d 培養(yǎng)期間，其0.01，0.03，0.05 g/mL 枯葉腐解液處理組過氧化氫酶活性較重茬土均呈升高變化，較對照土呈降低變化（P＜0.05），在40 d達到高峰，且土壤過氧化氫酶活性均隨培育時間的延長呈先升后降的趨勢，而0.07 g/mL 枯葉腐解液處理組在60 d 較重茬土顯著降低（P＜0.05），重茬土的過氧化氫酶活性較對照的降低。比較而言，重茬土壤和相同質量濃度枯葉腐解液對2周齡苗的根際土壤過氧化氫酶活性影響比8周齡苗大。

圖9 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對2周齡苗根際土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.9 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of catalase in the rhizosphere soilof 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

圖10 不同質量濃度的枯葉腐解液和重茬土壤對8周齡苗根際土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.10 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrationss on the activity of catalase in the rhizosphere soil of 8 weeks P.cablinin its stem cutting

3 討論與結論

微生物在土壤中只占很小的比例，但它們在氮、磷、硫和鐵等元素的循環(huán)中發(fā)揮著至關重要的作用，不僅作為影響植物生長發(fā)育的重要因子，而且與植物病害發(fā)生有密切的關聯(lián)[23,26]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物根際微生態(tài)的失衡可能是引起作物連作障礙的主要原因[19,27]。土壤性質也可以改變微生物群落的結構，微生物被認為是監(jiān)測土壤質量變化最敏感的生物指標之一[28]。土壤性質的惡化、以及根系分泌物(包括化感物質)的積累，可能對根際土壤的微生物群落產生重大影響。在以往的研究[29]中，隨著作物的持續(xù)單作，細菌和放線菌總數(shù)下降，真菌(尤其是致病真菌)的數(shù)量增加，連作會使微生物的種類和豐富度發(fā)生變化，打破其分布的平衡[30-31]，從而導致植株生長緩慢或發(fā)育不良，對后茬的產量和品質產生嚴重的影響[32]。張重義等[33]研究發(fā)現(xiàn)，地黃連作后，其根際細菌的種類及數(shù)量的有所減少，而且結構趨于單一化。許多研究認為，在連作的過程中，其連作土壤中的微生物群落構成會從“細菌型”向“真菌型”轉化[34]，從而導致根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡[35-37]，而細菌型土壤是土質優(yōu)良的一個重要指標，真菌型土壤則相反。

作物栽培生產中，由于前茬植株的殘枝與土壤加上雨水的腐解作用，產生的化感物質對后茬作物的直接影響，以及由于前茬根系分泌物、殘株腐解液對土壤微生態(tài)的影響，導致了連作障礙的發(fā)生[38-40]，許多作物如玉米、黃瓜等殘株都能產生大量的化感物質影響自身或其他作物的生長發(fā)育[41-42]。植物可以通過根系分泌物和凋落物對土壤進行反饋調節(jié)，也同時向土壤釋放化感物質，而這些化感物質也抑制植物根系和改變土壤微生物群落結構[42]。通過在非連作土壤中添加廣藿香植株腐解液，結果顯示，低質量濃度處理的土壤細菌和放線菌數(shù)量較非連作土和連作土的增多，真菌數(shù)量較非連作土和連作土的減少；而高質量濃度（0.07 g/mL）枯葉腐解液呈現(xiàn)相反的效果，這一現(xiàn)象驗證了由于前茬的殘株腐解物的積累導致的廣藿香連作障礙的可能性。

土壤酶活性作為衡量土壤微生物活性的重要指標，在土壤營養(yǎng)循環(huán)及轉化上發(fā)揮著重要作用。脲酶是土壤中的主要酶類之一，它能加速土壤有機質的化學反應，其活性高低與土壤營養(yǎng)物質轉化能力、肥力水平、污染狀況密切相關。多酚氧化酶是復合性酶，可降解土壤中酚類物質，減緩植物間的化感作用[43]。酸性磷酸酶參與分解土壤中和植株體內的有機磷，在有機磷分解和再利用方面起重要作用[44]。蔗糖酶又稱轉化酶，直接參與土壤有機質的代謝過程，一般情況下，土壤有機質含量越高，蔗糖酶活性越強，其活性可以作為評價土壤熟化程度和肥力水平[45]。土壤中的過氧化氫酶能促進土壤中過氧化氫的分解，其土壤中濃度大小直接表明過氧化氫對作物根系和土壤微生物的毒害作用[46]。本研究表明，連作導致土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性降低的變化，說明廣藿香連作導致根際土壤營養(yǎng)循環(huán)受阻。通過在非連作土壤中添加廣藿香植株腐解液，結果顯示，不同質量濃度腐解液作用下，幾種酶活性均較重茬土的顯著降低。表明了廣藿香的殘株腐解對于根際土壤酶活性有顯著影響，當殘株凋落物在土壤中積累到一定程度時，對于根際土壤酶活性起到抑制作用。

本研究表明，廣藿香連作及一定質量濃度的植株腐解液，導致了土壤細菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加，并導致土壤與碳，氮，磷循環(huán)相關的幾種酶活性的下降，說明連作的土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)失衡、酶活性降低，可能是廣藿香連作障礙產生的重要因素，其中由于殘株的腐解作用引起的土壤微生物比例失衡在廣藿香連作障礙中起了重要的作用。