板藍(lán)根中淀粉含量與活性成分含量的相關(guān)性研究*

李曉晨，魏 巍，張建逵，李 麗，牛 蕾

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，性苦，寒，氣微，歸心、胃經(jīng)。具有清熱解毒，涼血利咽之功效[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為：板藍(lán)根藥材以“粉性大（足）者為佳”[2]。粉性強(qiáng)即為淀粉含量高，但研究表明，其活性成分為（R，S）-告依春、靛藍(lán)和靛玉紅[3]等。本實(shí)驗(yàn)研究板藍(lán)根淀粉含量與其活性成分含量之間的相關(guān)性，為板藍(lán)根栽培藥材提供質(zhì)量控制依據(jù)，并檢驗(yàn)“粉性大者為佳”的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與材料

UV-3010紫外可見雙光束掃描分光光度計(jì)（日本日立集團(tuán)）；BP 211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；1100型高效液相色譜儀（G1314A型VWD檢測(cè)器，G1311A型四元泵，AT-130型柱溫箱）（大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

甲醇（色譜純）；甲醇、無水乙醇、高氯酸、乙酸乙酯等均為分析純；蒽酮（上海源葉生物科技有限公司）；濃H2SO4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；可溶性淀粉（Solarbio科技有限公司）；（R，S）-告依春對(duì)照品、靛藍(lán)對(duì)照品、靛玉紅對(duì)照品均購于上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為：KA0816CA14、K18M7C1和Z25N8B48799。純度均≥98%。

1.3 樣品

從不同收集地藥店購進(jìn)10批不同產(chǎn)地的板藍(lán)根飲片，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張建逵副教授鑒定，為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，具體來源見表1。

表1 飲片樣品來源表Tab.1 Source of prepared slices

2 實(shí)驗(yàn)方法[5]

2.1 板藍(lán)根淀粉含量測(cè)定

2.1.1 試液的配制 2%蒽酮試劑：精密稱取1g蒽酮于50mL乙酸乙酯中溶解，置4℃暗處貯藏；80%乙醇；9.2mol·L-1HClO4[6]。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱量0.03g樣品粉末于15mL離心管中，加入80%乙醇溶液8mL，80℃水浴提取 3 次（30、10、10min），棄去上清液，殘留物加入 6mL 的 9.2mol·L-1HClO4，快速振蕩搖勻，反應(yīng)5min，靜置，沉淀后上清液移置100mL容量瓶中，重復(fù)3次，蒸餾水定容，搖勻，即得。

2.1.3 樣品測(cè)定 精密量取1mL供試品溶液于15mL離心管中，蒸餾水補(bǔ)足至2mL，并加入2%蒽酮試劑0.5mL，緩慢加入5mL 98%的濃H2SO4，快速搖勻，于沸水中顯色1min，快速取出置于冰水浴中冷卻5min，取出后室溫放置5min，另取2mL蒸餾水為空白對(duì)照，同法處理，于630nm處測(cè)定吸光度值。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取0.05g淀粉于小燒杯中，加入 18mL 9.2mol·L-1HClO4，溶解后轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加蒸餾水置刻度。分別量取該溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL，照 2.1.3 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=9366.7X+0.0021，r=0.9997。結(jié)果表明，淀粉含量在0～0.375mg·mL-1內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.1.5 方法學(xué)考察

（1）經(jīng)方法學(xué)考察，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合試驗(yàn)要求。

（2）加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取S2樣品粉末5份，每份 10mg（淀粉含量為 35.18%），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，精密吸取1mL供試品溶液于15mL離心管中，并加入0.4mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液，蒸餾水補(bǔ)足至2mL，將所得淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液混合后顯色并測(cè)定其吸光度，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of additive recovery

測(cè)得板藍(lán)根淀粉的平均回收率為101.12%，RSD值為2.80%。

2.2 （R,S）-告依春、靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件采用Waters symmetry-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以 A- 甲醇，B- 水為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)?0～15min，90%～85%B；15～20min，85%～78%B；20～30min，78%～20%B；30min～40min，20%B；流速:1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)采用切換波長(zhǎng)，0～20min，254nm；20～40min，285nm；柱溫，30℃；進(jìn)樣量，10μL。在此色譜條件下（R，S）-告依春，靛藍(lán)，靛玉紅分離度均大于1.5，其拖尾因子在0.95～1.05，分離度良好，在該色譜條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的色譜圖Fig.1 Reference substance solution（A）and（B）the chromatogram of test sample solution

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 ?。≧，S）-告依春、靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品適量，精密稱定，同置于10mL的棕色容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，超聲0.5h，0.45μm微孔濾膜濾過，制成每1mL含（R，S）-告依春，靛藍(lán)，靛玉紅各 0.90，0.85，0.40mg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定各樣品2g，加200mL 75%的乙醇，回流提取2h，過濾，濃縮并用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為供試品溶液備用。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸?。≧，S）-告依春、靛藍(lán)、靛玉紅的混合對(duì)照液 2，4，6，8，10，12μL，進(jìn)樣分析。將各對(duì)照品的質(zhì)量作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程，見表3。

表3 3種成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationship of the three components

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)上表中淀粉含量及（R，S）-告依春含量進(jìn)行相關(guān)性分析，淀粉含量與（R，S）-告依春含量的回歸方程為:Y=0.0013X-0.0076，r=0.1122（P＞0.05 為差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），淀粉含量與靛藍(lán)含量的回歸方程為:Y=-0.9511X+38.742，r=0.3422（P＞0.05 為差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），淀粉含量與靛玉紅含量得到回歸方程為:Y=8×10-5X-0.0014，r=0.3547（P＞0.05 為差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。因此，板藍(lán)根淀粉含量與其主要藥用成分之間并無明顯相關(guān)性。

表4 板藍(lán)根淀粉及（R，S）-告依春、靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determine the contents of（R，S）-epigoitrine，indigo and indirubin

4 討論與結(jié)論

按照2015版《中國藥典》的規(guī)定[1]，板藍(lán)根中（R，S）-告依春含量不得少于0.02%，照此標(biāo)準(zhǔn)，上述10批藥材中僅有4批合格，合格率僅為40%，因此，相關(guān)部門對(duì)該藥材的質(zhì)量應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，板藍(lán)根淀粉含量與主要活性成分無相關(guān)性?！胺坌源螅ㄗ悖┱邽榧选边@一經(jīng)驗(yàn)并不適用。筆者認(rèn)為，古代板藍(lán)根藥材來源多為野生品，而目前藥用的板藍(lán)根幾乎全部為栽培品，通過施肥促進(jìn)初生代謝產(chǎn)物淀粉含量的增加，而未必能促進(jìn)活性成分含量的提高，因此，才會(huì)出現(xiàn)“粉性大（足）者為佳”這一經(jīng)驗(yàn)不適用的情況。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，栽培中藥過程中要注意到生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)藥材質(zhì)量的影響?；钚猿煞侄酁榇紊x產(chǎn)物，環(huán)境的脅迫作用可能是促進(jìn)其形成的主要原因。因此應(yīng)該對(duì)栽培的板藍(lán)根予以適當(dāng)?shù)沫h(huán)境脅迫，來提高活性成分含量。并抑制淀粉生成量或增大其消耗量，來提高活性成分含量。該藥材的栽培技術(shù)還需要更加深入的研究。

本實(shí)驗(yàn)探討了板藍(lán)根藥材淀粉含量與其活性成分含量之間的相關(guān)性，本研究可為板藍(lán)根藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及板藍(lán)根栽培品的質(zhì)量控制提供參考。