芒果葉中總黃酮提取工藝優(yōu)化及金屬離子螯合活性研究*

關(guān) 麗,趙惠茹,許 菲,李偉澤，徐遠(yuǎn)濤

（1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021；2.陜西盤(pán)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 柞水714000）

芒果葉因其富含具有生物活性的黃酮類(lèi)化合物而備受關(guān)注，提取工藝研究主要集中在使用微波輔助提取法和超聲提取法[14-16]。微波提取具有加熱時(shí)間短、產(chǎn)品質(zhì)量好、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等優(yōu)點(diǎn)但提取過(guò)程處于密封系統(tǒng)，短時(shí)間內(nèi)無(wú)法確定較適宜的提取溫度及物料受高溫加熱處理，勢(shì)必影響提取效果；超聲提取法工藝簡(jiǎn)單便捷，但使用微波提取與超聲提取方法提取效果均不佳。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法研究芒果葉中總黃酮的乙醇回流提取工藝，并測(cè)試總黃酮的金屬離子螯合活性，為進(jìn)一步研究芒果葉中總黃酮的生物活性提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

UV-762紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海偉科儀器儀表有限公司）；SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DZTW調(diào)溫電熱套（北京市水紅明醫(yī)療儀器）；KQ5200B型超聲波清洗器；恒溫水浴鍋（江蘇科偉實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FA1004B電子精密天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

芒果葉（采自廣西南寧，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院高級(jí)實(shí)驗(yàn)員邊軍昌鑒定為漆樹(shù)科植物芒果Mangifera indica L.的葉）；蘆丁對(duì)照品（西安應(yīng)化生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：150213，純度≥98%）；95%乙醇（天津市紅巖試劑廠）；NaNO2（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；Al（NO3）3（天津市紅巖試劑廠）；NaOH（天津市科密歐有限公司）；石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），ZnSO4、CuSO4、FeCl3和 FeSO4均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為市售分析純，水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 總黃酮得率的測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取0.0502g蘆丁對(duì)照品，加適量60%乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中得0.5020mg·mL-1得蘆丁對(duì)照溶液，備用。

1.2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[17]分別量取蘆丁對(duì)照溶液 2、3、4、5、6、7mL 于 25mL 容量瓶中，加 1mL 5%NaNO2靜置 6min 后加 1mL 10%Al（NO3）3，再靜置6min后加5mL 4%NaOH，最后用60%乙醇定容搖勻靜置15min，以空白試劑為對(duì)照用紫外可見(jiàn)分光光度儀于510nm波長(zhǎng)處下測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=5.2855x-0.017，R=0.9996，表明蘆丁在 0.0416～0.1205mg·mL-1范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

1.2.1.3 總黃酮得率測(cè)定 稱取1.00g芒果葉粉末在不同條件下加熱回流提取兩次，合并兩次提取液抽濾并過(guò)濾后量取體積得提取液。精密量取一定體積的提取液于適量大小容量瓶中，加1mL 5%NaNO2溶液，靜置6min后加1mL 10%Al（NO3）3溶液，再靜置6min后加5mL 4%NaOH，用60%乙醇定容靜置15min，按2.1.2項(xiàng)下操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算芒果葉提取液的總黃酮含量Q（mg·mL-1），利用提取液中總黃酮得率計(jì)算芒果葉中總黃酮得率T（%）。

有了上述分析，學(xué)生不難回答問(wèn)題3-1，“下標(biāo)和相等”的前提是等式左右兩邊的項(xiàng)數(shù)要相同.比如，等式兩邊都是3項(xiàng)，即有結(jié)論：在等差數(shù)列{an}中，若m+n+l=p+q+r，則am+an+al=ap+aq+ar.

總黃酮得率 T（%）=Q×D×V/1000W×100%

式中 Q：芒果提取液中總黃酮含量，mg·mL-1；D：稀釋倍數(shù)；V：提取液體積，mL；W：芒果葉粉末質(zhì)量，g；總黃酮得率T（%）：提取所得總黃酮與所用芒果葉的質(zhì)量比。

1.2.2 提取條件的單因素試驗(yàn) 文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)[18]在黃酮提取中，提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比對(duì)提取含量的影響較大。故設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別以乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 乙醇濃度 精密稱取7份芒果葉粉末，每份約1g，分別加35mL濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，加熱回流45min，提取兩次?？傸S酮得率測(cè)定方法見(jiàn)1.2.1.3。

1.2.2.2 提取時(shí)間 精密稱取6份芒果葉粉末，每份約1g，每份加35mL濃度為60%的乙醇，分別加熱回流 15、30、45、60、75、90min，提取兩次?？傸S酮得率測(cè)定方法見(jiàn)1.2.1.3。

1.2.2.3 料液比 精密稱取5份芒果葉粉末，每份約1g，每份先加10mL 40%乙醇溶濕后分別加料液比為 10、15、20、25、30 濃度為 40%的乙醇，加熱回流45min，提取兩次?？傸S酮得率測(cè)定方法見(jiàn)1.2.1.3。

1.2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，使用Design-Expert8.06軟件安排中心點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，選擇提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比3個(gè)因素分別為A、B、C，每個(gè)因素設(shè)為五個(gè)水平，用-α、-1、0、1、+α 表示。以總黃酮含量T（%）為響應(yīng)值。

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)最終優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，方法同單因素試驗(yàn)。

1.2.5 金屬離子螯合活性 取驗(yàn)證試驗(yàn)后得到的提取液0.5mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。分別將 FeSO4、CuSO4、FeCl3、ZnSO44 種金屬離子鹽配置成含金屬離子100μM的溶液，再分別與提取液進(jìn)行體積1∶1混合，稀釋成含金屬離子濃度為50μM的芒果葉總黃酮溶液。使用紫外分光光度計(jì)在200～500nm范圍內(nèi)對(duì)含金屬離子的總黃酮液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響 圖1A表明：隨著乙醇濃度增大，總黃酮含量增加，在40%時(shí)達(dá)到最佳，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)40%后，黃酮含量明顯下降?？赡苁且?yàn)殡S著乙醇濃度不斷增大，溶劑極性變小，黃酮溶解度降低。因此，選擇回流提取的乙醇濃度為30%～60%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 圖1B表明，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮含量緩慢增加，在45min時(shí)達(dá)到最佳，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)45min后，黃酮含量緩慢下降。因此，選擇回流提取時(shí)間為40～75min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響 圖1C表明，隨料液比增大，總黃酮含量增加，在1∶25時(shí)達(dá)到最佳，當(dāng)料液比超過(guò)1∶25后，黃酮含量緩慢下降?？赡苁且?yàn)殡S著溶劑量增加，黃酮溶解度增大，但溶劑量過(guò)大又會(huì)減弱體系的傳質(zhì)和傳熱，不利于提取。因此，選擇回流提取的料液比為1∶15～1∶30進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)Fig.1 Single factor experiments

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)選出最佳的提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比范圍，進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平表Tab.1 Factors and levels table of test

以總黃酮含量T（%）為響應(yīng)值，星點(diǎn)設(shè)計(jì)最終有20組試驗(yàn)方案，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experimental design and results

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到回歸方程為Q=10.31-1.42A+0.27B+0.011C+0.19AB-0.11AC-0.44BC-0.59A2-0.24B2-0.47C2，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

由表 3 可知，該模型 P＜0.01，失擬項(xiàng) P＞0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.8184，說(shuō)明該回歸方程的擬合度較好，結(jié)果可靠。A、B、AB、A2項(xiàng)的 P＜ 0.05，對(duì)總黃酮含量（T）均有顯著性影響，再繪制效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖2。

由此得到，芒果葉總黃酮富集純化的最優(yōu)工藝為乙醇濃度34%、料液比23mL·g-1、提取時(shí)間60min，總黃酮含量為19.17%。

圖2 效應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，測(cè)得總黃酮含量分別為11.65%、11.12%、11.24%，平均11.34%，與預(yù)測(cè)值（19.17%）相當(dāng)（RSD=2.45%）。表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.4 金屬離子螯合活性

使用紫外分光光度計(jì)在200～500nm范圍內(nèi)對(duì)不含或者含 FeSO4、CuSO4、FeCl3、ZnSO44 種金屬的總黃酮液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果使用Origin 8處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 金屬離子對(duì)芒果葉總黃酮螯合的影響Fig.3 Chelation effect of metal ions on total flavonoids in mango leaves

將不加金屬離子溶液的芒果葉提取液與加入后的對(duì)比，曲線之間吸光度變大表示芒果葉總黃酮與金屬離子發(fā)生螯合。圖中可以看出，芒果葉總黃酮對(duì)Cu2+的螯合作用最強(qiáng)，對(duì)Fe2+和Fe3+的螯合作用稍弱，對(duì)Zn2+的螯合作用不明顯。因此，芒果葉總黃酮對(duì)金屬離子的螯合作用有望應(yīng)用于阿爾茨海默癥的治療中。

3 結(jié)論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是一種常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精度高、模型預(yù)測(cè)效果好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化工、食品等領(lǐng)域。本研究是以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為自變量，總黃酮提取量為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)與效應(yīng)面法對(duì)芒果葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的提取工藝條件為乙醇濃度34%，提取時(shí)間60min，液料比23∶1；在此條件下黃酮類(lèi)化合物的得率為11.34%，與預(yù)測(cè)值的偏差為2.45%，芒果葉中黃酮含量的實(shí)測(cè)值與響應(yīng)面法優(yōu)化的預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型可靠。

阿爾茨海默病患者腦內(nèi)金屬離子堆積，容易造成Aβ蛋白異常沉積從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷，因此，金屬離子螯合劑可作為治療阿爾茨海默病的靶點(diǎn)，目前FDA公布的處于臨床研究的該類(lèi)化合物有PBT2，它可以維持腦內(nèi)銅離子和鋅離子的穩(wěn)態(tài)[19]，芒果葉中總黃酮對(duì)金屬離子的螯合活性為我們從天然產(chǎn)物中尋找金屬離子螯合劑提供了一個(gè)新思路。