• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肺動脈高壓關(guān)鍵基因的篩選及生物信息學(xué)分析

    2020-09-07 02:56:48仲紅艷唐珊趙飛飛王大新
    中國循環(huán)雜志 2020年8期
    關(guān)鍵詞:差異基因肺動脈關(guān)鍵

    仲紅艷,唐珊,趙飛飛,王大新

    肺動脈高壓是一種嚴(yán)重的致命性疾病,其可能是特發(fā)性的,也可能是先天性心臟病、自身免疫病、感染等疾病的最終結(jié)果[1],不管病因為何,病理特征都是肺血管重構(gòu),隨后右心室重構(gòu),如果無有效治療措施,最終可致右心衰竭和死亡[2]。據(jù)估計,全球目前約1%的人口患有肺動脈高壓,在65歲以上的人群中,這一比例高達(dá)10%[3],且在女性中更為流行,男女比例約為1:4[4]。隨著規(guī)范的臨床診療,患者5年生存率已提高到50%~60%[5]。但由于肺動脈高壓分子機制尚不清楚,目前的治療方案通常側(cè)重于緩解癥狀,而不是干預(yù)疾病進(jìn)展。最近幾年,隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展,產(chǎn)生了大量的基因信息,肺動脈高壓作為常見重大疾病之一,其基因芯片數(shù)據(jù)的發(fā)展已成為研究新趨勢和熱點。因此,本研究利用信使RNA(mRNA)和微小RNA(microRNA)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集來識別肺動脈高壓發(fā)生的關(guān)鍵基因和重要通路,并構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),從基因?qū)用娣治龇蝿用}高壓發(fā)生的潛在分子機制,為探索肺動脈高壓治療提供一些新思路。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)來源

    從美國國立生物中心的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲取2個mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE113439、GSE117261和1個microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE67597,樣本均來源于人肺組織,各個數(shù)據(jù)集的特征見表1。

    表1 各數(shù)據(jù)集特征

    1.2 差異基因獲取方法

    用R軟件中的“sva”包去除2個mRNA數(shù)據(jù)集批間差后通過“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)分析,最后以P<0.05和|log2FC | >0.5(“FC”表示差異表達(dá)倍數(shù))為閾值篩選出mRNA數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因,另外,用GEO2R在線分析工具處理microRNA數(shù)據(jù)集,以P<0.05和|log2FC | >1為閾值篩選出差異表達(dá)的microRNA。

    1.3 基因分析軟件

    通過DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,且GO和KEGG各項以P<0.05為篩選條件。STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白之間相互作用可視化網(wǎng)絡(luò)圖(PPI),TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異microRNA靶基因,Cytoscape 3.6.1軟件獲取關(guān)鍵基因、關(guān)鍵模塊和構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。

    2 結(jié)果

    2.1 篩選差異基因

    mRNA數(shù)據(jù)集(GSE113439和GSE117261)共包含73個肺動脈高壓樣本和36個正常肺組織樣本。通過R軟件的“sva”包去除批間差(圖1),用“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)分析,并以P<0.05和|log2FC |>0.5為篩選條件,發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比,肺動脈高壓患者肺組織中有226個基因存在差異表達(dá),其中141個為上調(diào)基因,85個為下調(diào)基因,對這些差異基因做聚類分析,見火山圖(圖2)。另外,microRNA數(shù)據(jù)集(GSE67597)中包含7個肺動脈高壓樣本和8個正常肺組織樣本。利用GEO2R在線分析工具從microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中獲得29個差異表達(dá)microRNA,其中17個表達(dá)上調(diào),12個表達(dá)下調(diào)。

    圖2 226個差異基因的火山圖

    2.2 差異基因功能和信號通路富集分析(表2~5)

    226個差異基因GO分析包含生物學(xué)過程、細(xì)胞定位、分子功能三部分。這些基因涉及的生物學(xué)過程主要有炎癥反應(yīng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞增殖、黏附等;基因主要位于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等;分子功能主要是肝素結(jié)合、整合素結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、轉(zhuǎn)運活性、趨化活性等。KEGG富集結(jié)果顯示這些基因主要參與造血細(xì)胞系、性別、錐蟲病、葡萄球菌感染等方面的信號通路。

    表2 226個差異基因生物學(xué)過程的GO分析結(jié)果

    表3 226個差異基因細(xì)胞定位的GO分析結(jié)果

    表4 226個差異基因分子功能的GO分析結(jié)果

    表5 226個差異基因KEGG富集分析結(jié)果

    2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

    將226個差異基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape 3.6.1軟件中的cytoHubba插件對 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中的基因用Degree算法進(jìn)行篩選。如圖3所示,圓圈顏色越深,代表其度值(degree)越大,本研究以度值排名前十的基因作為關(guān)鍵基因,分別為HGF(degree=23)、KIT(degree=24)、VCAM1(degree=29)、CXCL12(degree=30)、ITGAM(degree=47)、FPR1(degree=26)、CXCL9(degree=24)、CXCR1(degree=24)、TLR8(degree=35)、CXCR2(degree=23)。應(yīng)用Cytoscape 3.6.1中的MCODE插件發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有一個顯著簇集的模塊(圖4),圖4B模塊中包括12個基因,66個邊。將模塊基因進(jìn)行GO和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)其生物過程涉及細(xì)胞趨化、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生、血管生成,模塊基因主要位于高密度脂蛋白粒子、細(xì)胞外間隙,KEGG通路涉及趨化因子信號通路、受體相互作用、金黃色葡萄球菌感染、補體系統(tǒng)。

    圖3 226個差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

    2.4 預(yù)測差異靶基因和構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)(圖5、6)

    由于microRNA可促進(jìn)其靶mRNA降解或抑制翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),所以用TargetScan數(shù)據(jù)庫分開預(yù)測上調(diào)和下調(diào)的差異microRNA靶基因,并分開與差異基因取交集。結(jié)果顯示,17個表達(dá)上調(diào)的microRNA預(yù)測靶基因11 404個,與前述85個表達(dá)下調(diào)的差異基因取交集后得到37個下調(diào)差異靶基因,如圖5A所示。12個表達(dá)下調(diào)的microRNA預(yù)測靶基因13 679個,與前述141個表達(dá)上調(diào)的差異基因取交集后得到106個上調(diào)差異靶基因,如圖6A所示。將這143個差異靶基因做GO和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)其主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞趨化等生物學(xué)過程,涉及的通路主要是趨化因子信號通路、Rap1信號通路等。利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建差異microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖,如圖5B、6B所示,網(wǎng)絡(luò)中共有22個microRNA,用degree算法篩選,將度值排名前五的microRNA定為關(guān)鍵microRNA,分別為 hsa-miR-656(degree=52)、hsa-miR-4693-5p(degree=41)、hsa-miR-1253(degree=39)、hsamiR-4704(degree=37)和hsa-miR-302f(degree=34)。DAVID 6.8在線分析這5個關(guān)鍵microRNA對應(yīng)的差異靶基因,發(fā)現(xiàn)其主要參與細(xì)胞增殖、血管生成、炎癥反應(yīng)等過程,涉及的通路主要是腎素-血管緊張素系統(tǒng)、造血細(xì)胞系、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)、Ras相關(guān)蛋白 1(Rap1) 信號通路等。

    圖5 上調(diào)差異microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

    圖6 下調(diào)差異microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

    3 討論

    肺動脈高壓是進(jìn)展性難治性疾病,現(xiàn)有治療方法不能完全逆轉(zhuǎn)病理重塑,且尚未完全清楚發(fā)病機制,因此與肺動脈高壓相關(guān)的重要基因和通路有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。本研究分析mRNA和microRNA表達(dá)譜,分別獲得226個差異基因(141個上調(diào),85個下調(diào))和29個差異microRNA(17個上調(diào),12個下調(diào)),這說明肺動脈高壓發(fā)病機制復(fù)雜,是多個基因相互作用的結(jié)果。為進(jìn)一步了解這些基因在肺動脈高壓中的作用,本研究對差異基因、PPI網(wǎng)絡(luò)中顯著簇集的模塊基因、microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中差異靶基因分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)生物過程主要涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化、炎癥反應(yīng),這與已有研究報道一致,肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖,導(dǎo)致內(nèi)膜增厚、血管順應(yīng)性喪失,使血管腔變窄,阻礙血液流動,肺動脈壓升高。有研究表明趨化因子水平與肺血流動力學(xué)、右心室功能相關(guān),趨化因子也參與肺血管重構(gòu)過程,如促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移等[6]。炎癥研究也越來越受青睞,有報道肺動脈周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤,炎性細(xì)胞可釋放各種細(xì)胞因子和趨化因子,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,平滑肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肺血管重構(gòu),且肺動脈高壓患者免疫力低下,炎癥容易誘發(fā)肺動脈高壓加重[7],所以靶向抗炎可能是治療肺動脈高壓新方向[8-10]。

    根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值大小識別出HGF、KIT、VCAM1、CXCL12、ITGAM、FPR1、CXCL9、CXCR1、TLR8、CXCR2這10個關(guān)鍵基因。HGF具有刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成作用[11],利用基因轉(zhuǎn)染HGF干預(yù)肺動脈高壓動物模型,發(fā)現(xiàn)HGF能降低肺動脈壓力從而改善肺動脈高壓[12]。KIT編碼的一種Ⅲ型受體酪氨酸激酶,與其受體結(jié)合后磷酸化,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、趨化和細(xì)胞分化[13],KIT突變有嚴(yán)重的致癌作用,如胃腸道間質(zhì)瘤、黑色素瘤、急性髓細(xì)胞白血病等[14]。VCAM1編碼由促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的黏附分子,有研究報道系統(tǒng)性硬化癥合并肺動脈高壓(lSSc-PAH)中VCAM1升高[15],但不能作為lSSc-PAH特異性診斷標(biāo)志物[16]。CXCL9、CXCL12屬于趨化因子中CXC亞家族,研究表明CXCL9與心臟重構(gòu)相關(guān)[17],血中CXCL12水平升高與特發(fā)性肺動脈高壓患者右心室功能障礙有關(guān)[18],利用CXCL12中和作用可減輕肺部巨噬細(xì)胞浸潤,從而改善大鼠肺動脈高壓[19]。CXCR屬于趨化因子受體家族,趨化因子受體和配體結(jié)合發(fā)揮重要生物學(xué)功能,例如CXCL8是CXCR1和CXCR2的共同配體,靶向過表達(dá)CXCL8受體(即CXCR1和CXCR2)的肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞,可通過阻斷炎癥細(xì)胞聚集而減輕肺動脈高壓[20]。CXCL12是CXCR4的特異性配體,CXCL12-CXCR4軸參與多種組織的病理過程,缺乏CXCL12或CXCR4的小鼠不能存活,而且有神經(jīng)、血管、心臟方面的發(fā)育缺陷[21]。ITGAM基因編碼CD11b,與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性有關(guān),調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化、遷移、黏附[22]。FPR1對血管系統(tǒng)的動態(tài)可塑性有重要意義[23],抑制FPR1能減輕肺部炎癥和缺氧再灌注心肌損傷[24]。TLR8屬于Toll樣受體家族,TLR8激動劑有顯著的抗腫瘤效應(yīng)[25]。綜上,HGF、VCAM1等6個關(guān)鍵基因已報道與肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展相關(guān),KIT、ITGAM、FPR1、TLR8這4個關(guān)鍵基因目前在肺動脈高壓中尚無具體研究,但也可能是潛在治療靶點,需進(jìn)一步研究。

    microRNA是一種小的非編碼RNA,研究發(fā)現(xiàn)microRNA失調(diào)與肺動脈高壓的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān),本研究從microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中識別出hsamiR-656、hsa-miR-4693-5p、hsa-miR-1253、hsamiR-4704和hsa-miR-302f這5個關(guān)鍵microRNA。一項薈萃分析報道m(xù)iR-656與多種癌癥預(yù)后相關(guān)[26],研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA NORAD通過吸附miR-656促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[27]。miR-1253通過靶向WNT5A抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,可能是治療非小細(xì)胞肺癌的治療靶點[28]。另外,KIT、VCAM1和CXCL9這三個關(guān)鍵基因是miR-4693-5p靶基因,CXCL9、CXCL12和VCAM1也分別是miR-1253、miR-4704和miR-302f的靶基因。雖然目前尚無這5個關(guān)鍵microRNA在肺動脈高壓中的具體研究,但其GO分析提示可能參與發(fā)病機制,這為以后的研究提供一些參考。

    本研究尚有不足之處,首先,這些在肺動脈高壓組中差異表達(dá)的基因,尤其是關(guān)鍵基因和關(guān)鍵microRNA,需要通過細(xì)胞實驗和臨床樣本進(jìn)一步驗證。其次,這些差異表達(dá)基因和差異 microRNA分別是從不同患者肺組織樣本中篩選,所以結(jié)果會因樣本的不同而影響??傊?,本研究結(jié)果除了揭示肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中涉及的關(guān)鍵基因和通路及以生物信息學(xué)方法驗證已有研究,也為探索新的治療策略提供了一定的理論依據(jù)。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    差異基因肺動脈關(guān)鍵
    ICR鼠肝和腎毒性損傷生物標(biāo)志物的篩選
    高考考好是關(guān)鍵
    81例左冠狀動脈異常起源于肺動脈臨床診治分析
    基于RNA 測序研究人參二醇對大鼠心血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響 (正文見第26 頁)
    肺動脈肉瘤:不僅罕見而且極易誤診
    體外膜肺氧合在肺動脈栓塞中的應(yīng)用
    SSH技術(shù)在絲狀真菌功能基因篩選中的應(yīng)用
    獲勝關(guān)鍵
    NBA特刊(2014年7期)2014-04-29 00:44:03
    肺癌合并肺動脈栓塞癥的CTA表現(xiàn)
    生意無大小,關(guān)鍵是怎么做?
    中國商人(2013年1期)2013-12-04 08:52:52
    露出奶头的视频| 色综合色国产| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久久大精品| 伦理电影大哥的女人| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产男靠女视频免费网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品av视频在线免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| av国产免费在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 嫩草影院精品99| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲18禁久久av| 中国美白少妇内射xxxbb| 淫秽高清视频在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 国产69精品久久久久777片| 国产成人福利小说| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲国产精品久久男人天堂| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本一本二区三区精品| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美国产日韩亚洲一区| 能在线免费观看的黄片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久人人精品亚洲av| 99国产极品粉嫩在线观看| 一区福利在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲无线在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩av在线大香蕉| 精品午夜福利在线看| 男女边吃奶边做爰视频| 成人精品一区二区免费| 麻豆成人午夜福利视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 99热只有精品国产| 久久这里只有精品中国| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男人舔奶头视频| 国产视频一区二区在线看| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品人妻久久久影院| 网址你懂的国产日韩在线| 一个人看的www免费观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 一个人观看的视频www高清免费观看| 22中文网久久字幕| 亚洲国产精品合色在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人av在线播放网站| 在线观看午夜福利视频| 久久亚洲国产成人精品v| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成人国产麻豆网| 内地一区二区视频在线| 黄色视频,在线免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 久久精品夜色国产| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本一本二区三区精品| 男女视频在线观看网站免费| 啦啦啦啦在线视频资源| 波野结衣二区三区在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 悠悠久久av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲图色成人| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 淫妇啪啪啪对白视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久性生活片| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 天堂影院成人在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美在线一区亚洲| 男插女下体视频免费在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 看片在线看免费视频| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩精品中文字幕看吧| ponron亚洲| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲自拍偷在线| 亚州av有码| 91在线精品国自产拍蜜月| 两个人视频免费观看高清| 亚洲欧美清纯卡通| 国产高清视频在线播放一区| 两个人的视频大全免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 美女高潮的动态| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一区二区三区高清视频在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本与韩国留学比较| 亚洲欧美日韩无卡精品| 无遮挡黄片免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 少妇被粗大猛烈的视频| 日日撸夜夜添| 国产精品一及| 成人特级av手机在线观看| 麻豆国产av国片精品| 一本精品99久久精品77| 久久久久免费精品人妻一区二区| av中文乱码字幕在线| 综合色av麻豆| 欧美极品一区二区三区四区| 在线a可以看的网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 天堂动漫精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 99久久精品热视频| 草草在线视频免费看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久99热这里只有精品18| 国产精品,欧美在线| 久久精品影院6| 精品乱码久久久久久99久播| 色在线成人网| 久久精品人妻少妇| 美女大奶头视频| 亚洲美女视频黄频| 俺也久久电影网| 日本一本二区三区精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品乱码久久久久久99久播| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲18禁久久av| 老司机影院成人| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本黄大片高清| 变态另类丝袜制服| 韩国av在线不卡| 色5月婷婷丁香| 日本色播在线视频| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品1区2区在线观看.| 久久中文看片网| 国产片特级美女逼逼视频| 真人做人爱边吃奶动态| 最好的美女福利视频网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲三级黄色毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 级片在线观看| 男人舔奶头视频| 夜夜爽天天搞| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 看非洲黑人一级黄片| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美高清成人免费视频www| 一a级毛片在线观看| 在现免费观看毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99热只有精品国产| 欧美3d第一页| .国产精品久久| 高清日韩中文字幕在线| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产亚洲精品av在线| 国产日本99.免费观看| 亚洲图色成人| 赤兔流量卡办理| 午夜影院日韩av| 黄色视频,在线免费观看| 欧美人与善性xxx| 一级黄色大片毛片| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品一区二区性色av| 久久精品国产清高在天天线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品一二三区在线看| 99精品在免费线老司机午夜| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产成人91sexporn| 一区二区三区免费毛片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 我要搜黄色片| 国产成人a∨麻豆精品| 91精品国产九色| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲国产色片| 十八禁国产超污无遮挡网站| .国产精品久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品国产成人久久av| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产v大片淫在线免费观看| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品久久久久久久电影| 久久久午夜欧美精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 少妇的逼水好多| 搞女人的毛片| 97超碰精品成人国产| 亚洲人成网站在线播| a级一级毛片免费在线观看| 国产毛片a区久久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 色综合亚洲欧美另类图片| 一级毛片久久久久久久久女| 国产真实乱freesex| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 大香蕉久久网| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品一区www在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产高清激情床上av| 午夜精品在线福利| 亚洲欧美成人精品一区二区| av国产免费在线观看| 性色avwww在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国模一区二区三区四区视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产高清激情床上av| a级毛片免费高清观看在线播放| 如何舔出高潮| 久久久久久久久中文| 中出人妻视频一区二区| 97热精品久久久久久| 久久久国产成人免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久国产网址| av天堂在线播放| 国产成人福利小说| 一区二区三区免费毛片| 国产精品久久久久久久久免| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 插阴视频在线观看视频| 丝袜喷水一区| 久久精品91蜜桃| 国产精品爽爽va在线观看网站| 99久久成人亚洲精品观看| 此物有八面人人有两片| 最近手机中文字幕大全| 成年版毛片免费区| 偷拍熟女少妇极品色| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 日本欧美国产在线视频| av福利片在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲电影在线观看av| 欧美精品国产亚洲| 色综合色国产| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久成人免费电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品人妻久久久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 波多野结衣高清作品| 性色avwww在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲真实伦在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人欧美大片| 99热网站在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 97碰自拍视频| 成人av在线播放网站| 婷婷精品国产亚洲av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜激情福利司机影院| 国产高潮美女av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av卡一久久| 黄色配什么色好看| 欧美激情在线99| 欧美+日韩+精品| 激情 狠狠 欧美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费观看精品视频网站| 国产成人福利小说| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费高清视频大片| 国产精品电影一区二区三区| 床上黄色一级片| 淫妇啪啪啪对白视频| av免费在线看不卡| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲综合色惰| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 99热这里只有是精品在线观看| 1000部很黄的大片| 精品人妻熟女av久视频| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品一区www在线观看| 我的老师免费观看完整版| 99久国产av精品国产电影| 一级黄色大片毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 两个人视频免费观看高清| 不卡视频在线观看欧美| 欧美激情在线99| 久久久久国产网址| 精品午夜福利在线看| 在线看三级毛片| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成人福利小说| 日韩高清综合在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 中出人妻视频一区二区| 悠悠久久av| 尾随美女入室| 欧美高清成人免费视频www| av国产免费在线观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲最大成人中文| 十八禁网站免费在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩大尺度精品在线看网址| 美女大奶头视频| 在线免费十八禁| 国产黄片美女视频| 91久久精品国产一区二区三区| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲无线观看免费| 欧美精品国产亚洲| 亚洲人成网站在线播| 波多野结衣高清无吗| 亚洲欧美清纯卡通| 成年版毛片免费区| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲精品日韩av片在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一级毛片我不卡| 午夜久久久久精精品| 日韩欧美 国产精品| 欧美成人a在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产一区二区在线观看日韩| 高清毛片免费观看视频网站| 99精品在免费线老司机午夜| 91av网一区二区| 欧美色视频一区免费| 亚洲色图av天堂| 国产精品三级大全| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜福利18| 熟女人妻精品中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲av一区综合| 一级毛片aaaaaa免费看小| 草草在线视频免费看| 久久99热6这里只有精品| av在线蜜桃| 国产精品久久久久久av不卡| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久中文看片网| 色av中文字幕| 嫩草影视91久久| 国产亚洲精品久久久com| 欧美不卡视频在线免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲在线观看片| 成人国产麻豆网| 免费看日本二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av视频在线观看入口| 久久久久久久久中文| 精品久久久久久久久av| 欧美日本视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费av不卡在线播放| 毛片女人毛片| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 免费av毛片视频| 国产精品一区二区免费欧美| 露出奶头的视频| 日本熟妇午夜| 97热精品久久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 秋霞在线观看毛片| eeuss影院久久| 久久精品国产亚洲av天美| 免费电影在线观看免费观看| 午夜视频国产福利| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 看十八女毛片水多多多| 一本一本综合久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产清高在天天线| 麻豆一二三区av精品| 观看美女的网站| 国语自产精品视频在线第100页| 国产亚洲av嫩草精品影院| 又粗又爽又猛毛片免费看| 免费看日本二区| 精品一区二区免费观看| 99久久精品一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲经典国产精华液单| 简卡轻食公司| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99久久成人亚洲精品观看| 99在线人妻在线中文字幕| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久6这里有精品| 五月玫瑰六月丁香| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品久久电影中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 蜜桃久久精品国产亚洲av| www日本黄色视频网| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品,欧美在线| 99久国产av精品| 美女大奶头视频| 久久99热6这里只有精品| 国产精品福利在线免费观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 九九爱精品视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成熟少妇高潮喷水视频| 日本 av在线| 亚洲国产精品国产精品| 久久久成人免费电影| 亚洲第一电影网av| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美bdsm另类| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 免费观看的影片在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美激情久久久久久爽电影| av在线播放精品| 不卡视频在线观看欧美| 一个人免费在线观看电影| 欧美日韩国产亚洲二区| 舔av片在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 激情 狠狠 欧美| 日韩成人伦理影院| 俄罗斯特黄特色一大片| 搡老熟女国产l中国老女人| 乱人视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美日本视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品一及| 亚洲国产精品国产精品| 日韩精品有码人妻一区| 精品日产1卡2卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 国产爱豆传媒在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产成人aa在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日韩一本色道免费dvd| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日韩av不卡免费在线播放| 中文字幕精品亚洲无线码一区| av天堂在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美另类亚洲清纯唯美| 热99在线观看视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久久精品大字幕| 69人妻影院| 伦理电影大哥的女人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费观看人在逋| 中国美白少妇内射xxxbb| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色播亚洲综合网| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲最大成人手机在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩欧美 国产精品| 秋霞在线观看毛片| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜久久久久精精品| 免费电影在线观看免费观看| 天堂网av新在线| 亚洲最大成人av| 日本熟妇午夜| 一本久久中文字幕| 日本免费一区二区三区高清不卡| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日本色播在线视频| 99久久成人亚洲精品观看| 国产精品三级大全| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲七黄色美女视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲av中文av极速乱| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费av毛片视频| 国产成人a区在线观看| 久久久久久大精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费搜索国产男女视频| 免费观看在线日韩| 热99re8久久精品国产| eeuss影院久久| 最近最新中文字幕大全电影3| a级毛片a级免费在线| 黄色配什么色好看| 精品欧美国产一区二区三| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲18禁久久av| 欧美人与善性xxx| 亚洲高清免费不卡视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 精品不卡国产一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 一区福利在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 男女视频在线观看网站免费| 日韩欧美 国产精品| 老司机午夜福利在线观看视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 日韩欧美在线乱码| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品久久久久久久久免| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久久久久久中文| 两个人视频免费观看高清| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级黄片播放器| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| av卡一久久| 日韩精品青青久久久久久|