栝蔞桂枝湯聯(lián)合奧卡西平對(duì)癲癇病人血清miR-21及miR-222水平的影響

陳 剛

癲癇是由于多種因素引起、反復(fù)短暫性發(fā)作的大腦神經(jīng)元高頻異常放電，是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)病人至少70萬例，且呈逐年上升趨勢(shì)，該病嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，造成極大的家庭負(fù)擔(dān)與社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。目前，西醫(yī)治療以長期口服藥物為主，副作用頻發(fā)，且病人無法保證良好的依從性，易反復(fù)發(fā)作，一旦停藥，甚至有加重癥狀的可能。奧卡西平較傳統(tǒng)抗癲癇藥物卡馬西平具有藥效穩(wěn)定、副作用少、耐受性良好等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于臨床治療，且長期使用會(huì)發(fā)現(xiàn)消化系統(tǒng)不適、頭痛、頭暈等不良反應(yīng)[2-3]。因此，尋找有效的、病人耐受性好的治療方法已成為研究熱點(diǎn)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有不良反應(yīng)少、療效穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。癲癇在中醫(yī)學(xué)中屬于“癇病”，其發(fā)病與脾腎陽虛、脈絡(luò)阻滯密切相關(guān)，臨床治療多以溫陽解肌、祛邪通絡(luò)為主[4]。栝蔞桂枝湯是由經(jīng)典方劑桂枝湯加栝蔞而成，解肌發(fā)表舒筋療效顯著，常用于癇病的治療。本研究探討栝蔞桂枝湯聯(lián)合奧卡西平對(duì)癲癇病人血清miR-21及miR-222水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月—2018年1月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的325例癲癇病人，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組。觀察組163例，男85例，女78例；年齡35～66(50.01±6.11)歲；病程1.3～5.0(3.13±0.71)年；特發(fā)性癲癇71例，隱源性癲癇92例。對(duì)照組162例,男84例，女78例；年齡34～66(49.98±6.21) 歲；病程1.2～5.0(3.09±0.74)年；特發(fā)性癲癇72例，隱源性癲癇90例。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)通過，所有病人均簽署知情同意且能積極配合至研究結(jié)束。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 中醫(yī)診斷：符合中醫(yī)癇病標(biāo)準(zhǔn)[5]，①全面發(fā)作，發(fā)病急驟，猝然倒地，伴四肢抽搐，呼之不應(yīng)，蘇醒后與常人無異；②單純部分性發(fā)作，局部肢體抽搐，但未倒地，可伴周身多汗、言語功能障礙及惡心嘔吐等癥狀，發(fā)作數(shù)分鐘后緩解；③符合痰瘀阻滯、脾腎陽虛證候，主要表現(xiàn)為神疲乏力、腰膝酸軟、記憶力下降、懶言少氣、納呆便溏，舌紫暗或淡，苔膩且厚，脈弦澀或弦滑。西醫(yī)診斷：符合癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，一過性短暫反復(fù)發(fā)作；典型異常的腦電圖表現(xiàn)可見棘波、綜合波或慢波。所有病人病程均在1年以上且既往未正規(guī)服用抗癲癇藥物。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 病人存在精神、認(rèn)知功能障礙；對(duì)研究相關(guān)藥物過敏者；惡性腫瘤病人；因顱腦外傷、腦血管意外、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等引起的癥狀性癲癇。

1.4 治療方法 對(duì)照組予以奧卡西平片(生產(chǎn)企業(yè)：Novartis Pharma Schweiz AG.Switzerland；進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)0.15 g：H20080092)治療，起始劑量每次0.15 g，每日兩次，根據(jù)病人臨床表現(xiàn)逐漸加藥，最高劑量不超過每日1.2 g。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予栝蔞桂枝湯治療，組方：栝蔞根20 g，炒桂枝9 g，炒白芍9 g，干姜9 g，紅棗6 g，甘草 6 g。每日1付，以水煎煮取汁，共200 mL，早晚分服100 mL。兩組均治療3個(gè)月。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血清白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)及N-甲基-D-天冬氨酸受體NR1亞基(N-methyl-D-aspartate receptor 1，NMDAR1)表達(dá)水平 分別于治療前后采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血清IL-6、IL-1β及NMDAR1表達(dá)水平。

1.5.2 發(fā)作次數(shù) 記錄病人癲癇發(fā)作次數(shù)，計(jì)算平均次數(shù)。

1.5.3 中醫(yī)證候評(píng)分 參照《中醫(yī)證候?qū)W》[7]分別于治療前及治療后評(píng)定兩組癲癇發(fā)作時(shí)伴隨癥狀，包括頭暈、頭痛、胸悶、疲乏、失眠、記憶困難、抑郁，分值越高提示癥狀越重。

1.5.4 不良反應(yīng) 記錄所有病人治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括惡心嘔吐、腹痛腹瀉、便秘、肝腎損害等。

1.5.5 血清miR-21及miR-222表達(dá)水平 分別于治療前后采集所有病人5 mL靜脈血，以10 000 r/min離心血清，將TRIZOL裂解液中每1 mL加入氯仿0.2 mL進(jìn)行裂解，采用無RNA酶水進(jìn)行洗滌，再以10 000 r/min離心5 min獲得RNA。將混合液于70 ℃下干浴3 min，之后加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，并進(jìn)行冰水浴，待試管內(nèi)外溫度均衡時(shí)加入0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，于37 ℃環(huán)境下水浴60 min，常溫下靜置5 min，待其完全溶解并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照β-actin模版，在反應(yīng)體系中將上游引物、SYBR Green 1染料、dNTP、下游引物加入反應(yīng)體系并使得其總體積至20 μL后待檢，于55 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min、93 ℃ 2 min反應(yīng)條件下循環(huán)40次，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.6 臨床療效評(píng)定 病人癥狀、體征完全消失或基本消失，且中醫(yī)證候積分減少≥95%為臨床控制；病人癥狀、體征改善明顯，中醫(yī)證候積分減少70%～<95%為顯效；病人癥狀、體征較前好轉(zhuǎn)，中醫(yī)證候積分減少30%～<70%為有效；病人癥狀、體征較前無明顯變化甚至進(jìn)一步加重，中醫(yī)證候積分減少<30%為無效?？傆行?臨床控制+顯效+有效。

2 結(jié) 果

2.1 兩組治療前后血清IL-6、IL-1β及NMDAR1表達(dá)水平比較 治療前，兩組血清IL-6、IL-1β及NMDAR1表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組IL-6、IL-1β及NMDAR1表達(dá)水平較治療前均降低，且觀察組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組治療前后血清IL-6、IL-1β及NMDAR1 表達(dá)水平比較(±s) 單位：ng/L

2.2 兩組治療前后癲癇發(fā)作次數(shù)比較 治療前，兩組癲癇發(fā)作次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組癲癇發(fā)作次數(shù)較治療前減少，且觀察組少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組治療前后癲癇發(fā)作次數(shù)比較(±s) 單位：次

2.3 兩組治療前后中醫(yī)證候評(píng)分比較 治療前，兩組中醫(yī)證候評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組中醫(yī)證候評(píng)分較治療前均降低，且觀察組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表3。

表3 兩組治療前后中醫(yī)證候評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.4 兩組臨床療效比較 治療后，觀察組總有效率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(90.2%與77.2%，P<0.01)。詳見表4。

表4 兩組臨床療效比較

2.5 兩組不良反應(yīng)比較 治療期間，觀察組不良反應(yīng)總發(fā)生率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10.4%與20.4%，P<0.05)。詳見表5。

表5 兩組不良反應(yīng)比較

2.6 兩組治療前后血清miR-21及miR-222表達(dá)水平比較 治療前，兩組血清miR-21及miR-222表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組血清miR-21及miR-222表達(dá)水平較治療前均降低，且觀察組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表6。

表6 兩組治療前后血清miR-21及miR-222表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

癲癇是大腦功能異常的難治性疾病，以病人無預(yù)見性地反復(fù)短暫出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、感覺、意識(shí)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，且腦電圖檢查存在明顯異常，其發(fā)病率高，對(duì)病人健康及生活質(zhì)量水平造成嚴(yán)重威脅。藥物干預(yù)是癲癇的主要治療手段，如苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平及新型抗癲癇藥奧卡西平等，此類藥物可降低機(jī)體谷氨酸能神經(jīng)傳遞作用、改變細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)通路，進(jìn)而達(dá)到改善大腦病理代謝、加強(qiáng)生理功能的目的。由于癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其防治是目前醫(yī)學(xué)難題，藥物治療作用有限，部分病人長期使用出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)[8-10]。

中醫(yī)學(xué)理論體系中癲癇又稱“癇病”“羊角風(fēng)”，《黃帝內(nèi)經(jīng)》首次提出此病與七情相關(guān)，《素問·奇病論》提出先天因素至關(guān)重要，中醫(yī)學(xué)歷經(jīng)多年研究對(duì)其發(fā)病機(jī)制及治療方法有獨(dú)到之處[11]。人體在六淫、先天因素、七情過極等多種因素作用下，致痰濁、風(fēng)陽、瘀血諸邪膠結(jié)、郁積于內(nèi)，一旦出現(xiàn)氣機(jī)逆亂，即導(dǎo)致清竅受蒙、癇病發(fā)作。此病部位在腦，但與五臟相關(guān)，尤其是與肝、脾、腎功能有關(guān)。脾為后天之本，可生化氣血、調(diào)暢氣機(jī)，一旦失于運(yùn)化，導(dǎo)致痰濁內(nèi)阻，誘發(fā)癇??；腎為先天之本，一旦虧虛導(dǎo)致腦髓失于濡養(yǎng)，使痰邪上逆蒙蔽清竅而致癇；肝為將軍之官，性條達(dá)，有主藏血、疏泄之功，可理氣疏肝、開竅化痰。栝蔞桂枝湯始于《金匱要略》，方中君藥為栝蔞根，可潤燥養(yǎng)筋、滋養(yǎng)津液、舒筋緩脈，配以散寒止痛、助陽化氣、溫經(jīng)通脈的桂枝，加上緩中止痛、養(yǎng)血柔肝、斂陰收汗的白芍，輔以健脾益氣的大棗，最后以甘草調(diào)和諸藥，共奏養(yǎng)營生津、緩痙之急、柔潤筋脈、解肌調(diào)營之功，對(duì)癲癇療效甚佳[12-14]。堯雪洲等[15]通過對(duì)70例病人進(jìn)行對(duì)照分組研究，結(jié)果表明栝蔞桂枝湯聯(lián)合膽星寧癇顆粒對(duì)癲癇具有一定的治療作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組將栝蔞桂枝湯與奧卡西平聯(lián)用，病人癲癇發(fā)病次數(shù)較對(duì)照組減少，中醫(yī)證候評(píng)分降低，臨床療效顯著，且不良反應(yīng)減輕。

癲癇的發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，普遍認(rèn)為其主要機(jī)制是由于離子通道異常、神經(jīng)遞質(zhì)異常、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常、細(xì)胞因子功能異常等導(dǎo)致機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制與興奮機(jī)制失衡、神經(jīng)元過度興奮、異常放電導(dǎo)致發(fā)病，其中谷氨酸作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)具有重要作用[16-17]。NMDAR1是機(jī)體普遍存在的離子型谷氨酸受體，可調(diào)控離子通道，在正常條件下，保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦表達(dá)過度即產(chǎn)生神經(jīng)興奮毒性作用，引起神經(jīng)元異常放電，癲癇發(fā)作。

癲癇發(fā)作與細(xì)胞因子異常表達(dá)密切相關(guān)，IL-6、IL-1β可調(diào)節(jié)神經(jīng)功能，導(dǎo)致谷氨酸釋放，促使癲癇發(fā)作。因此，癲癇發(fā)作越頻繁，病人血清IL-6、IL-1β及NMDAR1表達(dá)水平越高?？拱d癇新藥奧卡西平通過抑制離子通道，穩(wěn)定神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)揮抑制異常放電作用[18-20]。現(xiàn)代藥理學(xué)證明，栝蔞桂枝湯方劑中白芍、桂枝等藥材均有一定的抗癲癇鎮(zhèn)靜作用。白芍的有效成分及提取物可減輕神經(jīng)細(xì)胞受損，抑制腦棘波頻繁發(fā)放，并在癲癇發(fā)作時(shí)保護(hù)神經(jīng)元；桂枝所含成分對(duì)鈣離子通道有阻滯作用，可降低海馬場(chǎng)電位，抑制突觸傳遞，進(jìn)而減輕癲癇癥狀。白芍、桂枝等促使人體中腦和延髓兒茶酚胺、5-羥色胺類物質(zhì)表達(dá)水平增加，抑制活性氧自由基，促使受損的神經(jīng)功能恢復(fù)[21-22]。李茜等[23]通過中藥湯劑聯(lián)合奧卡西平治療癲癇亦取得較好的臨床療效，病人血清NMDAR1、IL-1β、IL-6表達(dá)水平降低。本研究結(jié)果顯示，觀察組IL-6、IL-1β及NMDAR1表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯下降。

miRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常疾病病變過程中發(fā)揮重要作用。miR-222具有調(diào)節(jié)炎性因子作用，在IL-1β刺激作用下表達(dá)增強(qiáng)，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄和翻譯改變相關(guān)蛋白，使黏附分子、炎性因子表達(dá)異常，導(dǎo)致疾病發(fā)生。miR-21作為凋亡分子調(diào)節(jié)miRNAs，機(jī)體出現(xiàn)氧自由基大量增加、鈣超載時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)，增加凋亡分子調(diào)節(jié)作用。癲癇發(fā)作與體內(nèi)炎性因子過度釋放、凋亡分子異常表達(dá)密切相關(guān)，miR-21、miR-222可改變完整的神經(jīng)元鞘膜，損傷神經(jīng)元細(xì)胞，誘導(dǎo)異常放電，加重癲癇病情[24-26]。Gan等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)水平與癲癇癥狀呈明顯正相關(guān)，病人miRNA表達(dá)水平越高，癥狀越重。本研究治療后，觀察組與對(duì)照組miR-21、miR-222表達(dá)水平均明顯下降，觀察組通過栝蔞桂枝湯與奧卡西聯(lián)合使用，效果顯著。結(jié)合本研究細(xì)胞因子表達(dá)水平變化，考慮其作用機(jī)制可能為治療后病人血清炎性因子表達(dá)水平下降，因此miRNAs對(duì)炎性因子的直接調(diào)控作用降低，減少腦神經(jīng)元異常放電，降低病人體內(nèi)神經(jīng)毒性因子，具有抗凋亡效應(yīng)的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因表達(dá)增強(qiáng)，miR-21、miR-222下降，進(jìn)而減輕癲癇癥狀[28]。

綜上所述，栝蔞桂枝湯聯(lián)合奧卡西平可提高癲癇病人臨床療效，減少癲癇發(fā)作次數(shù)，減輕不良反應(yīng)，抑制血清miR-21及miR-222的表達(dá)水平。