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    羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子及心肌組織NF-κB表達(dá)的影響

    2020-09-07 06:34:16園,張
    關(guān)鍵詞:黃色素尼莫地平紅花

    張 園,張 妍

    心肌梗死是常見的嚴(yán)重心血管疾病,主要由冠狀動(dòng)脈急性持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死,是威脅人類健康和導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。臨床治療心肌梗死的手段主要通過藥物溶栓、心臟搭橋或介入方式,恢復(fù)心臟缺血冠狀動(dòng)脈血液供應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)再灌注[2]。短時(shí)間內(nèi)快速恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)造成缺血再灌注損傷,嚴(yán)重影響再灌注治療及心臟功能恢復(fù),甚至出現(xiàn)心律失常、心肌梗死病情加重、心力衰竭等危重事件[3]。因此,如何減輕再灌注損傷已成為目前心血管疾病治療的研究熱點(diǎn)[4]。

    羥基紅花黃色素A是一種重要的黃酮類化合物,屬于查耳酮類化合物,是中藥紅花的主要藥效成分,具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、降血壓、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗心肌缺血、抗腫瘤等多種藥理作用[5-6]。為明確羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制,本研究探討羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子及心肌組織核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響,為臨床防治心肌缺血再灌注損傷提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g由承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 羥基紅花黃色素A(大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號(hào)A1228AS,純度≥98%),大鼠CD4、CD8酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒均購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)有限公司;NF-κB、NF-κB抑制蛋白激酶α(IκBα)、NF-κB抑制蛋白激酶β(Iκκβ)和β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自美國Thermo公司;ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜購自美國Millipoer公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京新利科技有限公司生產(chǎn),HL-B6型);生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn),型號(hào)BL-420S);Spectra Max iD5-多功能酶標(biāo)儀(中國上海美谷分子儀器有限公司);H1650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 分組 50只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(模型組)、尼莫地平組(陽性藥對(duì)照組,20 mg/kg)及羥基紅花黃色素A高劑量組(20 mg/kg)、羥基紅花黃色素A低劑量組(10 mg/kg),每組10只。各組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥物,假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。

    1.3.2 藥物干預(yù) 各組大鼠于造模前14 d分別灌胃給藥,陽性藥對(duì)照組灌胃尼莫地平(20 mg/kg),羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組分別給予羥基紅花黃色素A 20 mg/kg、10 mg/kg,假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積(5 mL/kg)生理鹽水,藥物干預(yù)期間各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食。

    1.3.3 造模 通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌缺血再灌注損傷模型[7]。各組大鼠于末次給藥后禁食、不禁水12 h,腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后仰臥固定,頸部、心前區(qū)備皮,碘伏消毒,切開頸部皮膚,分離氣管,以鹽酸利多卡因浸潤后,行氣管插管,連接動(dòng)物呼吸機(jī)(參數(shù):潮氣量為15 mL,呼吸頻率為1∶2)。沿胸骨左緣第3肋與第4肋間切開皮膚2.0~2.5 cm,使用小開胸器輕輕撐開切口,剪開心包,輕壓右側(cè)胸廓,擠出心臟,使用止血鉗將左心耳提起,確定冠狀動(dòng)脈左前降支(左心耳下方2 mm),以0號(hào)縫合線行高位或中位活結(jié)結(jié)扎,快速將心臟送回胸腔,清除胸腔內(nèi)空氣和血液并關(guān)閉胸腔,術(shù)中監(jiān)測(cè)心電圖Ⅱ?qū)?lián),以ST段、T波抬高作為判斷造模成功與否的標(biāo)準(zhǔn),結(jié)扎30 min后開胸,打開結(jié)扎線行再灌注,持續(xù)時(shí)間120 min,逐層縫合關(guān)胸,動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸。假手術(shù)組僅開胸、穿線但不結(jié)扎。測(cè)量各組大鼠缺血再灌注后左室舒張末期壓力(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)和左室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP),評(píng)價(jià)心臟功能。

    1.3.4 指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠缺血30 min再灌注120 min后,頸總動(dòng)脈取血3 mL,室溫靜置2 h,4 ℃條件下3 000 r/min離心5 min,分離血清,即刻檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平。取血完畢后,再取各組大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織(假手術(shù)組參照模型組相同部位取材),采用Western Blotting法檢測(cè)心肌組織NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表達(dá),具體方法為:液氮中研磨大鼠心肌組織,加入RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)裂解,BCA法進(jìn)行蛋白定量,加5×上樣緩沖液煮沸10 min,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜(電壓100 V,90 min),5%脫脂奶粉封閉過夜,NF-κB、IκBα、Iκκβ和內(nèi)參β-actin等一抗(1∶1 000)稀釋液室溫孵育2h,再以辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)稀釋液室溫孵育1 h,加顯色液顯色,按照ECL試劑盒說明書進(jìn)行操作,將發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上,反應(yīng)1 min,最后將膜放入暗室顯影。結(jié)果以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示,采用Image J軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析。

    1.3.5 心肌組織病理學(xué)檢查 取血完畢后,再取各組大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織(假手術(shù)組參照模型組相同部位取材),以4%的多聚甲醛溶液固定,4 ℃過夜,梯度乙醇脫水、石蠟包埋、制成4 μm切片,使用蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察左心室組織學(xué)改變。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠左心室組織變化 假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊有序,組織間隙水腫較輕微,僅有輕度瘀血,周圍組織有微量滲出,血管輕度擴(kuò)張。模型組大鼠心肌嚴(yán)重受損,心肌纖維扭曲斷裂,細(xì)胞腫脹,組織間隙水腫,細(xì)胞核散亂無序,染色疏松。與模型組比較,羥基紅花黃色素A各劑量組及尼莫地平組大鼠心肌纖維斷裂較少,組織間隙腫脹較輕,心肌間隙血管擴(kuò)張不明顯,組織間隙水腫較輕。詳見圖1。

    圖1 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠左心室組織光鏡圖(HE染色,400×) (A為假手術(shù)組;B為模型組;C為尼莫地平組;D為羥基紅花黃色素A高劑量組;E為羥基紅花黃色素A低劑量組)

    2.2 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟功能比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠LVEDP升高,LVSP降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組及尼莫地平組大鼠LVEDP降低,LVSP升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組與尼莫地平組LVEDP、LVSP比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

    表1 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟功能比較(±s) 單位:mmHg

    2.3 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組及尼莫地平組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組與尼莫地平組TNF-α、IL-6、CRP炎性因子水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

    表2 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子水平比較(±s)

    2.4 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織NF-κB、IκBα 和 Iκκβ蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)升高,IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組、尼莫地平組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)降低,IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組與尼莫地平組NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表達(dá)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。

    與假手術(shù)組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05。圖2 各組心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織 NF-κB、IκBα和Iκκβ蛋白表達(dá)比較

    3 討 論

    心肌缺血再灌注損傷是指心肌缺血后血液供應(yīng)恢復(fù),但缺血性損害未恢復(fù),反而進(jìn)一步加重,其病理機(jī)制復(fù)雜,與心肌細(xì)胞凋亡、炎性因子產(chǎn)生及核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等有關(guān)[8]。有研究表明,心肌缺血激活炎癥反應(yīng),急性炎癥反應(yīng)又引起繼發(fā)性心肌損傷,而再灌注又加重心肌急性炎癥反應(yīng)程度,心肌缺血再灌注引起機(jī)體炎癥反應(yīng)激活炎癥細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、CRP及干擾素等大量炎性因子,加重炎癥反應(yīng)[9]。

    NF-κB是一種具有調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子,在維持機(jī)體正常生理功能中發(fā)揮重要作用,介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,并參與調(diào)控細(xì)胞周期、分化和凋亡[10],靜息狀態(tài)時(shí),存在于細(xì)胞質(zhì)NF-κBp65、p50與IκBα組成的三聚體復(fù)合物,無活性;當(dāng)NF-κBp65、p50、IκBα三聚體被炎癥介質(zhì)激活后,細(xì)胞中Iκκβ磷酸化為p-Iκκβ,級(jí)聯(lián)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá);IκBα蛋白激活NF-κB信號(hào)通路,由于NF-κB與IκBα親和力較強(qiáng),IκBα表達(dá)量高,可抑制NF-κB活化,而IκBα表達(dá)量低,NF-κB活化程度較高[11]。NF-κB活化后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核,促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等多種炎性因子表達(dá)[12]。有研究顯示,NF-κB的異常激活與心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān),心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí),激活心肌組織NF-κB信號(hào)通路,心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)升高,IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)量降低[13]。本研究結(jié)果表明,羥基紅花黃色素A高劑量組、低劑量組、尼莫地平組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)低于模型組,IκBα、Iκκβ蛋白表達(dá)高于模型組。

    炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注引起心肌損傷的重要病理特點(diǎn)之一,主要表現(xiàn)為心肌局部炎癥細(xì)胞大量浸潤并合成,分泌CRP、TNF-α、IL-6等多種炎性因子。其中,TNF-α由活化單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,參與啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),IL-6由活化的成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,與TNF-α協(xié)同發(fā)揮作用,介導(dǎo)并加重炎癥反應(yīng),調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡[14-15]。本研究結(jié)果表明,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平高于假手術(shù)組,表明心肌缺血再灌注大鼠體內(nèi)存在持續(xù)性炎癥反應(yīng),與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致,而羥基紅花黃色素A可降低心肌缺血再灌注大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平,減輕炎癥反應(yīng)。

    本研究結(jié)果表明,羥基紅花黃色素A對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,可抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng),減輕心肌細(xì)胞損傷。本研究基于炎癥反應(yīng),從NF-κB信號(hào)通路探討羥基紅花黃色素A防治心肌缺血再灌注大鼠的作用機(jī)制,有關(guān)羥基紅花黃色素A治療心肌缺血再灌注損傷大鼠的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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