清達(dá)顆粒對(duì)腦缺血再灌注大鼠炎癥損傷的保護(hù)作用研究

賈貝貝，蔡巧燕，2，3，張 鈴，2，3，沈阿靈，2，褚劍鋒，2，3，彭 軍，2，3

已有研究證明，缺血缺氧所致的炎癥反應(yīng)是缺血性腦卒中重要的病理進(jìn)程，炎癥反應(yīng)是預(yù)防和治療腦缺血的關(guān)鍵[1]。 中藥清達(dá)顆粒是由國(guó)醫(yī)大師陳可冀院士60余年來治療高血壓的臨床經(jīng)驗(yàn)用方清眩降壓湯精簡(jiǎn)而來，具有清肝熱、平肝陽(yáng)、瀉心火的功效，對(duì)高血壓前期、新發(fā)1級(jí)高血壓證屬肝火上炎、肝陽(yáng)上亢具有良好的療效。結(jié)合前期藥效學(xué)研究結(jié)果，該方不僅能有效降低高血壓模型大鼠血壓，而且能抑制高血壓模型大鼠心臟炎癥反應(yīng)，從而抑制高血壓引起的心臟重構(gòu)[2-3]。因此，本研究利用大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型觀察中藥清達(dá)顆粒對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦局部炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，常規(guī)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(24±1)℃，濕度(55±5)%，術(shù)前12 h禁食、不禁水，術(shù)前4 h禁水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照國(guó)際倫理準(zhǔn)則和國(guó)家衛(wèi)生研究院關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)方針進(jìn)行，本研究得到福建中醫(yī)藥大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥清達(dá)顆粒由天麻12 g，鉤藤10 g，黃芩6 g，蓮子心5 g組成， 由江陰天江藥業(yè)有限公司制備成免煎顆粒劑并提供使用。中藥清達(dá)顆粒一劑為1日使用量，每劑濃縮為清達(dá)顆粒免煎劑后為8 g，成品每包54 g，臨床每日使用免煎劑藥量為8 g。藥材鑒定和藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由天江藥業(yè)完成，均按藥典標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格。

1.3 主要試劑 白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(英國(guó)Abcam公司)；蘇木素染色液、伊紅染色液和2% TTC染色液(北京索萊寶科技有限公司)；即用型免疫組化試劑盒(鼠/兔)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS，粉劑)、粉劑型抗原修復(fù)液(檸檬酸法)、凱基DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；硅膠線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司，L 3600)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 主要儀器 切腦模具(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)和生物組織石蠟包埋機(jī)(孝感亞光公司)；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)、DM4000B顯微鏡(德國(guó)徠卡有限公司)；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(Leica LAS V 4.1和Motic 6.0)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型制備及動(dòng)物分組 局灶性腦缺血再灌注模型采用硅膠線栓插入法栓塞大鼠大腦中動(dòng)脈制備[4]。SD大鼠禁食12 h，禁水4 h后以2%戊巴比妥鈉0.225 mL(100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉，采用線栓法阻斷大鼠一側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈血流(分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，切開后向上置入硅膠線致頸內(nèi)動(dòng)脈，直至感到有阻力為止)，90 min后拔除線栓開始灌注，扎緊頸內(nèi)動(dòng)脈，縫合各層皮膚，完成腦缺血再灌注模型。整個(gè)手術(shù)過程中使用暖燈照耀，維持肛溫37 ℃。將40只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為造模組和假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠除不置入線栓外，其余操作同造模組。大鼠清醒后，參照Z(yǔ)ea Longa進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分[5]，詳見表1。術(shù)后剔除1分和5分的大鼠，有死亡或造模失敗大鼠，如數(shù)補(bǔ)上。再按隨機(jī)數(shù)字表法將造模組分為模型組和清達(dá)顆粒低劑量(QDG-L)組、高劑量(QDG-H)組，造模組大鼠均經(jīng)灌胃途徑給藥，QDG-L組給藥劑量為0.8g/(kg·d)，QDG-H組給藥劑量為1.6 g/(kg·d)，其余各組大鼠均灌服等量生理鹽水，術(shù)后24 h開始干預(yù)，每日1次，干預(yù)期間，每日測(cè)定各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化。

表1 Zea Longa 神經(jīng)功能損傷評(píng)分表

1.5.2 藥物制備 中藥清達(dá)顆粒臨床用量每日33 g，每劑濃縮成顆粒為8 g，成品顆粒內(nèi)每克含原生藥量為4.125 g。給藥劑量根據(jù)臨床使用劑量換算得來，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算大鼠灌胃給藥劑量，依照體表面積折算系數(shù)，人與大鼠折算系數(shù)為0.018，換算成大鼠為0.8 g/(kg·d)，相當(dāng)于生藥量3.3 g/kg。清達(dá)顆粒以生理鹽水充分溶解配成濃度為0.8 mg/mL和1.6 mg/mL的混懸液(前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)采用了3個(gè)劑量)。

1.5.3 TTC染色 將取出的新鮮大鼠完整腦組織置于-20 ℃冰箱30 min后，取出稍復(fù)溫，將腦組織置于大鼠切腦模具中用刀片去除嗅球、小腦及低位腦干部分，每個(gè)腦組織均沿冠狀面平均切成5片，厚度約2 mm；將腦片放于2%的TTC染色液中，置于37 ℃恒溫箱避光染色30 min，將染色后的腦片按順序整齊地放置于白色背景板上，用相機(jī)拍照。

1.5.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 各組大鼠干預(yù)7 d后，先用2%戊巴比妥鈉以0.225 mL(100 g)對(duì)大鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉成功后先用預(yù)冷的生理鹽水經(jīng)心臟灌注沖洗血液，再用4%的多聚甲醛固定液進(jìn)行灌注，待大鼠肢體頭頸僵硬時(shí)斷頭取腦，置于4%的多聚甲醛固定液中常溫放置，48 h后將組織取出并在流水下沖洗8 h，之后修切組織置入75%乙醇中過夜脫水，次日再進(jìn)行梯度脫水、透明和浸蠟包埋，包埋好的石蠟塊，用切片機(jī)切成5 μm切片，之后脫蠟入水后進(jìn)行HE染色。蘇木精染色時(shí)間為5 min(鏡檢)，伊紅染色時(shí)間為5 s，而后進(jìn)行脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡觀察并拍片。

1.5.5 免疫組化 石蠟切片脫蠟入水后，以檸檬酸法進(jìn)行熱抗原修復(fù)，冷卻后按照免疫組化試劑盒步驟進(jìn)行阻斷內(nèi)源性過氧化物酶→封閉→4 ℃低溫過夜孵育一抗(GFAP 1∶1 000，IL-1β 1∶200，IL-6 1∶200)→孵育二抗→加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶→DAB染色等操作，最后晾干封片，在顯微鏡下觀察并拍片，采用Motic Med 6.0 System圖像分析處理系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1 MCAO模型構(gòu)建情況 評(píng)價(jià)模型構(gòu)建是否成功和確認(rèn)模型構(gòu)建是否均一化，隨機(jī)選擇3只腦缺血再灌注術(shù)后24 h大鼠(給藥前)進(jìn)行TTC染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性腦缺血再灌注側(cè)腦組織梗死，呈蒼白色，提示模型構(gòu)建成功。詳見圖1。

圖1 TTC染色鑒定MCAO模型構(gòu)建情況

2.2 各組缺血再灌注后大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較，術(shù)后第1天模型組、QDG-L組和QDG-H組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增高(P<0.05)；術(shù)后第7天，QDG-L組和QDG-H組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠缺血再灌注后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.3 光鏡下各組腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血區(qū)GFAP病理結(jié)構(gòu) GFAP為星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，GFAP表達(dá)增強(qiáng)是星型膠質(zhì)細(xì)胞常見的特征性反應(yīng)之一。光鏡下觀察HE染色和GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注7 d后，假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞漿著色均勻，胞膜完整，星形膠質(zhì)細(xì)胞突起少且短；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間質(zhì)腫脹，缺血中心區(qū)細(xì)胞壞死缺如，細(xì)胞核固縮，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，突起變多且伸長(zhǎng)，且星形膠質(zhì)細(xì)胞核固縮，染色加深；QDG-L組和QDG-H組病理變化顯著減輕，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均明顯改善，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)減少。詳見圖2、圖3。

圖2 光鏡下各組腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血區(qū)GFAP病理結(jié)構(gòu)(400×)

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖3 各組腦缺血再灌注大鼠GFAP陽(yáng)性率比較

2.4 大腦皮質(zhì)缺血區(qū)炎性因子表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注 7 d后，模型組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)增多(P<0.05)；干預(yù)后，QDG-L組和QDG-H組炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)較模型組下降(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 光鏡下各組腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血區(qū)炎性因子表達(dá)(400×)

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

目前，臨床治療缺血性腦卒中多應(yīng)用藥物溶栓或介入治療實(shí)現(xiàn)再通，針對(duì)腦缺血病理機(jī)制，研發(fā)了一些新型藥物，但由于腦缺血及再灌注機(jī)制的復(fù)雜性，這些藥物治療腦缺血療效不理想，且毒副作用大。腦血管再通后組織、器官功能不能恢復(fù)反而損傷加重，稱為“缺血再灌注損傷”[6]。

本研究通過構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血模型探討中藥清達(dá)顆粒對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)功能、腦病理?yè)p傷和炎性細(xì)胞、炎性因子的影響。局灶性腦缺血模型制備方法較多，本研究采用硅膠線栓大鼠MCAO模型，普遍認(rèn)為該模型是腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，已逐漸取代開顱法而成為常用方法。此法主要是通過分離頸部左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，從CCA分叉處附近直接將硅膠線栓插入大鼠MCA，阻斷其起始端及所有側(cè)支循環(huán)的血液供應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是：造模不需要開顱，對(duì)其他生理結(jié)構(gòu)損傷??；手術(shù)時(shí)間短、動(dòng)物存活時(shí)間較長(zhǎng)；缺血部位較恒定，對(duì)非缺血側(cè)腦組織基本無損傷；感染概率較??；可精確控制缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間。為最大可能避免因阻塞不完全造成的實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格選取體質(zhì)量250～280 g的SD大鼠及與體質(zhì)量相符的硅膠線栓。

局部腦缺血再灌注對(duì)腦皮質(zhì)功能造成嚴(yán)重?fù)p傷，該區(qū)域是運(yùn)動(dòng)功能中樞，因此引起神經(jīng)功能缺失，根據(jù)Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法，損傷加重時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分增高[5]。本研究對(duì)大鼠造模后24 h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著升高，腦缺血再灌注后7 d內(nèi)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，清達(dá)顆粒能早期改善神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，隨著清達(dá)顆粒干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，干預(yù)7 d后，各給藥組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低。

局灶性腦缺血模型中，缺血灶腦組織大量細(xì)胞發(fā)生壞死，造成細(xì)胞丟失，葡萄糖和氧氣缺乏造成能量衰竭，引發(fā)細(xì)胞毒性水腫。大腦主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，即卒中后神經(jīng)元信號(hào)退化的關(guān)鍵傳遞因子谷氨酸，因缺氧缺糖導(dǎo)致谷氨酸無法排出而累積于腦內(nèi)引發(fā)興奮性氨基酸中毒，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡。腦缺血再灌注破壞小膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，缺血發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞被迅速激活，對(duì)缺血敏感的星形膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)被激活并釋放多種神經(jīng)毒性物質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，增加血腦屏障通透性，最終引起腦水腫及組織壞死[7-11]。本研究通過對(duì)各組大鼠患側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理染色發(fā)現(xiàn)，中藥清達(dá)顆粒能改善因缺血和再灌注導(dǎo)致的腦組織水腫、神經(jīng)細(xì)胞丟失、細(xì)胞核固縮變形、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。

隨著對(duì)腦缺血研究的深入，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)是主要的分子機(jī)制，由缺血損傷轉(zhuǎn)向炎癥損傷過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮重要作用[12]。腦缺血再灌注引起星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)加劇[13]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是除中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞之外的腦缺血再灌注損傷炎癥細(xì)胞，是腦組織中較大的膠質(zhì)細(xì)胞，其在腦組織中多分布于神經(jīng)元，腦缺血損傷首先引起毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，而星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后合成和分泌IL-1β、IL-6等炎性因子，這些炎性因子損傷周圍正常細(xì)胞，引起一系列腦組織損傷反應(yīng)，繼而發(fā)展為腦梗死[14-16]。GFAP特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，其表達(dá)量與星形膠質(zhì)細(xì)胞激活程度呈正相關(guān)，可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志。本研究通過對(duì)腦缺血再灌注后患側(cè)皮質(zhì)區(qū)GFAP蛋白進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠梗死側(cè)腦組織GFAP被激活，其數(shù)量增多，且激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞核呈固縮深染，細(xì)胞突起增多變長(zhǎng)，而各給藥組梗死側(cè)腦組織GFAP表達(dá)水平較模型組下調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞核較模型組飽滿，突起變少且縮短。提示中藥清達(dá)顆粒下調(diào)GFAP表達(dá)水平可能是保護(hù)缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

腦缺血再灌注急性期，IL-1β是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子[17]，可激活自身表達(dá)，刺激其他促炎介質(zhì)表達(dá)，并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞增殖，引起星形細(xì)胞膠質(zhì)化，造成腦損傷。IL-6來源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞等免疫細(xì)胞，其水平反映疾病損傷程度[18]。因此，抑制炎性因子表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注預(yù)后具有重要意義。本研究通過免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠患側(cè)皮質(zhì)區(qū)IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注7 d后，模型組患側(cè)皮質(zhì)區(qū)IL-6和IL-1β表達(dá)增多，而QDG-L組和QDG-H組患側(cè)皮質(zhì)區(qū)IL-6和IL-1β較模型組減少，提示腦缺血再灌注后清達(dá)顆粒抑制炎性因子IL-6和IL-1β表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

中藥清達(dá)顆粒是由陳可冀院士60余年來臨床治療高血壓的經(jīng)驗(yàn)方清眩降壓湯加減化裁而來，由天麻12 g、鉤藤10 g、黃芩6 g、蓮子心5 g四味中藥組成，具有清肝熱、平肝陽(yáng)、瀉心火功效，對(duì)高血壓前期、新發(fā)1級(jí)高血壓證屬肝火上炎、肝陽(yáng)上亢具有良好的療效。該方不僅能有效降低高血壓模型大鼠的血壓，抑制高血壓模型大鼠心臟炎癥反應(yīng)，從而抑制高血壓引起的心臟重構(gòu)，還能減輕自發(fā)性高血壓模型大鼠腦損傷(部分?jǐn)?shù)據(jù)尚未發(fā)表)[19]。李文君等[20]發(fā)現(xiàn)天麻素可降低血腦屏障通透性，通過降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)局灶性腦缺血損傷作用；高麗娜等[21]發(fā)現(xiàn)鉤藤堿能抑制缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的壞死和凋亡，提示鉤藤堿可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和壞死而對(duì)腦缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用；王文娟等[22]發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過抑制炎癥反應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用；余萬桂等[23]通過觀察蓮心堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷血清白介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)活性的影響，發(fā)現(xiàn)蓮心堿通過降低IL-1和TNF-α活性而發(fā)揮保護(hù)腦缺血作用。

綜上所述，中藥清達(dá)顆粒通過抑制腦缺血再灌注后大鼠腦皮質(zhì)梗死區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和局部炎癥反應(yīng)，減輕缺血再灌注后腦損傷，促進(jìn)腦功能恢復(fù)，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織的保護(hù)作用，但具體的炎癥調(diào)控機(jī)制尚不明確，今后將繼續(xù)探討清達(dá)顆粒調(diào)控腦局部缺血再灌注后相關(guān)炎癥反應(yīng)機(jī)制，以闡明其抑制炎癥的通路。