芘-鉻（Ⅵ）復合污染的共脫毒菌株的分離鑒定及特性研究

李亞茹，張雅芳，呂婷婷，顧俊俠，董新姣

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

多環(huán)芳烴芘和重金屬鉻（Cr）都是環(huán)境中的微量持久性污染物，往往同時或先后進入環(huán)境中.浙江省輕工業(yè)如皮革廠和電鍍廠等發(fā)展迅猛，其排放的廢水中含有大量重金屬如六價鉻，它具有極強毒性，對呼吸道和消化道有刺激、致癌和誘變作用[1-2]，對當?shù)卦斐闪藝乐氐闹亟饘巽t污染.與此同時，一些工業(yè)、交通和生活中煤、石油和木材等不完全燃燒時產(chǎn)生的多環(huán)芳烴也會進入到環(huán)境中[3-4]，這就在當?shù)丨h(huán)境中形成了普遍存在的多環(huán)芳烴和重金屬的復合污染，復合污染的存在加劇了生物毒性和處理的復雜性[5].微生物來源廣泛，用于治理環(huán)境污染成本低等優(yōu)勢，已成為解決復合污染的重要手段.目前絕大多數(shù)學者只關(guān)注單一污染物微生物修復相關(guān)工作研究，而去除重金屬和多環(huán)芳烴的共脫毒微生物及機理研究則報道較少[6].本研究利用富集培養(yǎng)方法從多環(huán)芳烴-重金屬污染較嚴重的廢水及土壤中分離、篩選芘-鉻（Ⅵ）共脫毒菌株，通過單因素實驗考察了溫度、pH、接種量、污染物濃度等因素對共脫毒菌株修復芘-鉻（Ⅵ）復合污染的最適條件，探索菌株脫毒特性，為復合污染的治理提供寶貴菌種資源和技術(shù)參數(shù).

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和芘、鉻（Ⅵ）溶液的配制

無機鹽培養(yǎng)基：硫酸銨1 g，七水硫酸鎂0.2 g，氯化鈣0.2 g，磷酸二氫鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉0.2 g，七水硫酸鐵0.01 g，蒸餾水1 L（固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉）.

LB培養(yǎng)基：蒸餾水1 L，加入蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，pH 7.5左右，121℃高壓滅菌30 min（固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉）.

芘、鉻（Ⅵ）的溶解及添加：取適量K2Cr2O7溶于無菌水中配制成50 g/L的鉻（Ⅵ）母液，用時取一定體積的母液加入培養(yǎng)基中混合即可.芘不易溶于水，母液配制用正己烷溶解定容至5 g/L.定性篩選菌株所用的固體平板，取30 μL芘涂布于平板上晾干備用.定量檢測除芘率的液體培養(yǎng)基，根據(jù)實驗需求的濃度將此母液加合適的體積于滅過菌的培養(yǎng)瓶中，靜置一定時間讓正己烷揮發(fā)掉，再加入培養(yǎng)液和鉻（Ⅵ）備用[7].

1.2 樣品采集和菌株分離

樣品采集：樣品來源于浙江省溫州市平陽水頭鎮(zhèn)的皮革廠、加油站、汽修廠附近的水樣和土樣.皮革制造業(yè)是此鎮(zhèn)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，其中皮革廠附近由于鉻鞣法廣泛應用于皮革工業(yè)，因此重金屬鉻是這類工業(yè)所排放廢水和污泥中的主要污染物質(zhì).加油站在裝載卸載石油以及加油過程中有微量石油的泄露.汽修廠在車輛維修中產(chǎn)生的有害廢物（如廢機油、廢電路板和油漆）長期積累.因此這些采樣點均為重金屬與多環(huán)芳香烴富集量超標具有代表性的地點，樣品采集后立即進行處理.

菌株富集：取土樣10 g和水樣10 mL分別接入到90 mL無機鹽培養(yǎng)基中，同時加入芘和鉻（Ⅵ），使芘的濃度最終為50 mg/L，鉻（Ⅵ）的濃度為10 mg/L和20 mg/L，于30℃，150 rpm搖床振蕩培養(yǎng)72 h.再將培養(yǎng)過的樣品各取10 mL轉(zhuǎn)接到各物質(zhì)濃度相同的培養(yǎng)基中，于30℃，150 rpm搖床振蕩培養(yǎng)72 h.

菌株分離：將富集培養(yǎng)過的菌液樣品移取50 μL均勻涂布于無機鹽平板（已事先加入終濃度為10 mg/L的鉻（Ⅵ），并取30 μL的芘母液涂布于平板上晾干），30℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察個體形態(tài)和菌落形態(tài)特征，挑取形態(tài)不同的單菌落劃線轉(zhuǎn)接于同樣成份的平板，重復4 - 5次，如此得到能夠耐受芘和鉻（Ⅵ）的純種菌株.

1.3 芘和鉻（Ⅵ）的檢測

芘的提?。簩⒕杲到廛藕蟮木杭尤?10 mL二氯甲烷，然后全部倒入分液漏斗中，另取10 mL二氯甲烷于三角瓶中清洗瓶壁，重復3次并將洗液移入分液漏斗中.萃取有機相，經(jīng)無水硫酸鈉去除殘留水相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸濃縮，最終用甲醇定容至1 mL，稀釋到100倍，待檢測[5].同法提取和分析對照樣品（即沒有菌加入，其它同菌液樣品）作為芘的起始濃度.

芘的檢測：HPLC法，條件：色譜柱為4.6 mm×150 mm烷基C18反相柱；流動相為色譜純甲醇，流速l mL/min，甲醇︰水 = 9︰1，柱溫30℃，進樣量10 μL，熒光檢測.

鉻（Ⅵ）的檢測：采用國標方法二苯碳酰二肼分光光度法[6].

1.4 芘-鉻（Ⅵ）去除率的分析

挑取單菌落于5 - 10 mL LB培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)一段時間至對數(shù)期（OD600約1.5），按5%（V/V）量接種于50 mL無機鹽培養(yǎng)液中，其中鉻（Ⅵ）濃度為20 mg/L，芘濃度為50 mg/L；30℃，150 rpm振蕩培養(yǎng)7 d.2 d時取樣檢測鉻（Ⅵ），7 d時取樣檢測芘濃度，樣品和空白對照（不加菌，其它同樣品）均設置3個平行重復.芘或鉻（Ⅵ）去除率的計算：R=（C0-C1)/C0×100%，其中R為去除率，C0為初始濃度，即空白對照中的芘或鉻（Ⅵ）濃度，C1為樣品中的芘或鉻（Ⅵ）濃度.

1.5 菌株16SRNA鑒定

采用分子克隆手冊[8]中方法進行細菌總DNA的提取，基因組DNA提取后，以此作為模板，以 16SRNA 基因的通用引物正向（P1）：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3′，反向（P2）：5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC-3′，作為引物進行PCR擴增.PCR擴增條件：95℃，預變性5 min；95℃，變性30 s，退火溫度55℃，30 s，72℃，延伸2 min，30個循環(huán)；然后72℃再延伸10 min，4 ℃保存.擴增結(jié)束后將該PCR產(chǎn)物送交公司測序后用NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast軟件進行比對分析.

1.6 菌株的脫毒特性研究

采用單因素實驗，選取溫度、pH、接菌量、芘濃度、鉻（Ⅵ）濃度等五個對菌株去除芘-鉻（Ⅵ）復合污染影響最明顯的因素，探究降解菌的脫毒特性.

不同溫度：分別設置不同溫度，20℃、30℃和40℃下，將菌株接種至芘濃度為50 mg/L、鉻（Ⅵ）濃度為20 mg/L的LB培養(yǎng)液中，置于pH 7.5，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下培養(yǎng)，分別測定7 d芘降解率和2 d鉻（Ⅵ）還原率，考察不同溫度對菌株共脫毒的影響.

初始pH的選擇：pH值分別調(diào)至6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，將菌株接種至芘濃度為50 mg/L、鉻（Ⅵ）濃度為20 mg/L的LB培養(yǎng)液中，置于pH 7.5，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下培養(yǎng)，分別測定7 d芘降解率和2 d鉻（Ⅵ）還原率，考察不同pH對菌株共脫毒的影響.

不同接種量：將接種量設置0.5%、5%、10%、30%和50%，分別接種至芘濃度為50 mg/L、鉻（Ⅵ）濃度為50 mg/L的LB培養(yǎng)液中，置于pH 9.0，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下培養(yǎng)，分別測定7 d芘降解率和2 d鉻（Ⅵ）還原率，考察不同接種量對菌株共脫毒的影響.

不同芘濃度：將菌株接種至鉻（Ⅵ）濃度為50 mg/L，芘濃度分別為0 mg/L、100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L的無機鹽培養(yǎng)液中，置于pH 9.0，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下培養(yǎng)，2 d測定鉻（Ⅵ）還原率，考察不同芘濃度對菌株還原鉻（Ⅵ）的影響.

不同鉻（Ⅵ）濃度：將菌株接種至芘濃度為50 mg/L，鉻（Ⅵ）濃度分別為0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)液中，置于pH 9.0，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min 條件下培養(yǎng)，7 d測定芘降解率，考察不同鉻（Ⅵ）濃度對菌株降解芘的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選結(jié)果及鑒定

富集培養(yǎng)后通過平板初篩得到約30株能夠抗芘-鉻（Ⅵ）復合污染的細菌菌株，再通過液體搖瓶培養(yǎng)后檢測其同時降解芘和還原鉻（Ⅵ）的能力，復篩得到6株具有共脫毒性能的菌株，在加有終濃度為50 mg/L芘和20 mg/L鉻（Ⅵ）的無機鹽培養(yǎng)液中，7 d后對芘有50%以上的降解率，同時對鉻（Ⅵ）有不同程度的還原.

將復篩得到的6株菌株提取其基因組DNA，成功提取的基因組DNA結(jié)果見圖1.以此基因組DNA作為模板進行16SrRNA基因的PCR擴增，可以看到擴增出16SrRNA基因結(jié)果，見圖2.圖中，M為DNA Marker，泳道1 - 6依次為菌株B，1，5，8，6，10.將PCR產(chǎn)物送交公司測序后用NCBI網(wǎng)站的Blast軟件進行比對，結(jié)果表明這6株菌分屬于Bacillussp.（.芽孢桿菌屬）、Raoultellasp.（.拉烏爾菌屬）和Serratiasp.（.沙雷氏菌屬）共3個屬，根據(jù)復篩中效率檢測，它們的綜合性能最優(yōu)者為6號，而1號效率雖不夠高，但屬于Raoultellasp.（.拉烏爾菌屬），比較少見此類菌具有降解芘或還原鉻（Ⅵ）能力，故選取 1號和 6號菌進一步研究，并將其命名為Raoultellasp.F1和Serratiasp.Z6，同時將其提交到 GenBank上，接收號為 KY006166和KY006167.

圖1 六株菌的基因組 DNA

圖2 六株菌的16SrRNA 基因

芘和鉻（Ⅵ）作為典型的有機和無機污染物一直都是研究熱點[9-11]，因為芘是具有四個稠環(huán)的多環(huán)烴很難降解，還易作為母體轉(zhuǎn)化為毒性極強的神經(jīng)毒劑苯并（a）芘，常被作為多環(huán)芳烴的指示物進行研究[12].鉻（Ⅵ）毒性很強，它能通過飲用水和食物鏈累積放大等進入動植物和人體[13]，引起“三致”效應（致畸、致癌、致突變）.而微生物可以將鉻（Ⅵ）還原成基本無毒的鉻（III）后從而進行鉻（Ⅵ）的解毒和去除.但芘-鉻（Ⅵ）復合污染研究還未引起足夠的重視，僅有少量報道關(guān)注于采用混合菌群對芘-鉻（Ⅵ）復合污染的土壤修復[5,14].我們這里篩選到6株具有芘-鉻（Ⅵ）共脫毒能力的細菌菌株，每一株菌都能同時降解芘和還原鉻（Ⅵ），這在以前還未報道，值得進一步優(yōu)化其共脫毒條件為后續(xù)研究奠定基礎.

2.2 溫度對菌株共脫毒的影響

在20℃、30℃和40℃下進行了菌株共脫毒效率的檢測，結(jié)果見圖3.由圖3可知，溫度對兩株菌還原20 mg/L鉻（Ⅵ）的能力有促進作用，并且Z6菌株優(yōu)于F1菌株；30℃和40℃顯著大于20℃，而30和40℃比較接近，其中40℃略大于30℃.在30℃時兩株菌株的芘降解能力是最好的，并且Z6菌株優(yōu)于F1菌株.溫度對兩株菌降解芘的影響規(guī)律是：30℃最優(yōu)，20℃最低，推測是20℃不適于菌體生長，菌體生長受到較大影響進而共脫毒能力減弱.溫度是微生物生長的重要條件，低溫可導致細胞膜凝固，引起物質(zhì)運送困難，而高溫則可使蛋白質(zhì)變性，故溫度成了影響微生物生長繁殖和生理代謝活動的最重要因素之一[15].鑒于兩株菌降解芘時 30℃最好，而還原鉻（Ⅵ）時最適溫度是40℃比30℃略高，綜合二者，采用30℃作為其最佳溫度.

圖3 不同溫度下菌株共脫毒效率

2.3 pH對菌株共脫毒的影響

pH設置6.0 - 10.0檢測兩株菌共脫毒效率，2 d后取樣測量鉻（Ⅵ）還原率，7 d后取樣測量芘降解率，結(jié)果見圖4.從圖4可以看出，Z6和F1都在pH 9.0時鉻（Ⅵ）還原率達到最好，其中Z6菌可以將20 mg/L鉻（Ⅵ）完全還原.兩菌降解芘的pH影響不同，它們都在pH：7.0 - 10.0的芘降解率比pH 6.0較高，Z6在pH 7.0最優(yōu)達到56.8%，而F1在pH 9.0的時候降芘率達到最大值60.6%.因此F1在pH 9.0降芘效果最好，Z6在pH 7.0降芘效果最好.絕大多數(shù)微生物的生長pH都在5.0 - 9.0之間[14]，細菌更適于在中性偏堿環(huán)境中生長，其代謝活動也傾向于在中性偏堿環(huán)境中有利，F(xiàn)1在pH 9.0時降芘和還原鉻（Ⅵ）效率都最優(yōu)，而Z6還原鉻（Ⅵ）最適pH也為9.0，但降芘最適pH為7.0，不同菌株可能降解芘和還原鉻（Ⅵ）的相關(guān)酶不同，所需求的最適pH值也會不同，很少數(shù)菌會在極堿性條件下如pH低于11.5下還原鉻（Ⅵ）[16].綜合pH對兩菌降芘率和降鉻（Ⅵ）率的影響結(jié)果，后續(xù)實驗統(tǒng)一采用pH 9.0.

圖4 不同pH下菌株共脫毒效率

2.4 接種量對菌株共脫毒的影響

經(jīng)pH和溫度優(yōu)化后，菌株的鉻（Ⅵ）還原率明顯提升，可以將20 mg/L鉻（Ⅵ）完全還原.后續(xù)實驗提高了鉻（Ⅵ）濃度以便檢測數(shù)據(jù)用于比較，采用50 mg/L的鉻（Ⅵ）和50 mg/L芘來分析不同接種量影響效果.在pH 9.0和30℃下，兩菌的接種量設置范圍是0.5% - 50%，結(jié)果見圖5.從圖5可以看出，Z6還原鉻（Ⅵ）的效率隨著接種量增加呈現(xiàn)先保持平穩(wěn)后迅速提高的趨勢，當達到50%接種量，其還原率高達83%.F1接種量從10%提高到30%對應的鉻（Ⅵ）還原率從8.0%激增到 32.4%，然后變化比較平穩(wěn)；接種量增加到 50%時，鉻（Ⅵ）還原率略有下降.Z6在接種量為 50%的時候降芘率達到最大為 47.0%，F(xiàn)1在接種量為 30%的時候降芘率達到最大57.9%.因此可以得出，兩株菌對鉻（Ⅵ）還原和芘降解受接種量影響有些差異，有限的培養(yǎng)液中營養(yǎng)隨菌量增加對F1的影響比對Z6更大.

2.5 不同鉻（Ⅵ）濃度對降芘的影響

由圖6可知，鉻（Ⅵ）濃度對兩株菌降解芘影響很大，不加鉻（Ⅵ）時F1和Z6對50 mg/L的芘降解率達到60%以上，而鉻（Ⅵ）濃度從0 mg/L上升到100 mg/L時兩株菌都幾乎不能再降解芘了.顯然這說明了鉻（Ⅵ）的毒性很強，它易透過細胞膜進入細胞，結(jié)合細胞內(nèi)大分子引起遺傳密碼的改變，進而引起細胞和生物體的突變和癌變[17].

圖5 不同接種量下菌株共脫毒效率

圖6 不同濃度鉻（Ⅵ）下菌株的降芘率

圖7 不同濃度芘下菌株的鉻（Ⅵ）還原率

2.6 不同芘濃度對鉻（Ⅵ）還原影響

由圖7可知，芘濃度對兩株菌的鉻（Ⅵ）還原能力基本沒有大的影響，兩菌株對芘的耐受性較高，當芘濃度達到1 000 mg/L時，F(xiàn)1和Z6兩株菌對鉻（Ⅵ）的還原效率沒有受太大影響.隨著芘濃度從0 mg/L上升到500 mg/L時鉻（Ⅵ）還原率都隨之有所增加，這說明一定濃度的芘對鉻（Ⅵ）的還原有輕微促進作用，這可能是由于這兩株菌可以利用芘作為碳源進而促進了其還原鉻（Ⅵ）的效率所致.芘在自然界中很難降解，但它具有四個苯環(huán)，理論上是可以作為碳源，這里分離出來的兩株菌具有降解芘的能力，這類菌株可以成為少數(shù)能夠降解和利用芘作為碳源的微生物菌種資源[18-19]，這也是菌株篩選工作重要意義的體現(xiàn).

3 結(jié) 論

本研究立足于國內(nèi)外PAHs-重金屬復合污染微生物修復的最新研究成果，結(jié)合復合污染領域研究發(fā)展趨勢，以溫州多環(huán)芳烴（芘）-重金屬鉻（Ⅵ）復合污染較為嚴重地域平陽水頭鎮(zhèn)為執(zhí)行地點，采集樣品進行共脫毒菌株的篩選，通過單因素實驗考察了菌株共脫毒的最適條件及其脫毒特性，得出以下結(jié)論.

1）從污染場所取樣、分離篩選得到兩株綜合性能較好的菌株F1和Z6，鑒定為Raoultellasp.和Serratiasp..

2）對菌株進行脫毒特性研究，對其從溫度、pH值、接種量、鉻（Ⅵ）濃度、芘濃度五個方面進行研究.兩株菌在30℃環(huán)境下對鉻（Ⅵ）還原和芘降解達到最好的效率.偏堿的環(huán)境對兩株菌還原鉻（Ⅵ）和降解芘的效率起到促進作用，但偏酸的環(huán)境兩株菌的適應性較差、降解效率較低.接種量的增加對兩菌株還原鉻降解芘均有促進作用，有限的培養(yǎng)液中營養(yǎng)隨菌量增加對 F1的影響比對Z6更大.鉻（Ⅵ）濃度越高對菌株降解芘的抑制作用越強，芘濃度為500 mg/L時，兩株菌還原鉻能力最好.

3）兩菌株在30℃，pH 9.0的條件下可以達到共脫毒最佳狀態(tài)，其中Z6菌株性能更優(yōu)，條件優(yōu)化后可以將50 mg/L芘降解到近60%，同時將20 mg/L的鉻（Ⅵ）完全還原.