吡格列酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制研究

孫蘭 張帆 石明雋 田平平 郭兵

摘 要 目的：探討吡格列酮（PIO）對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）的影響及可能機(jī)制，為防治糖尿病腎病提供理論依據(jù)及新靶點(diǎn)。方法：將大鼠腎小管細(xì)胞NRK-52E隨機(jī)分為對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（30 mmol/L葡萄糖）、PIO干預(yù)組（30 mmol/L葡萄糖+5.0 μmol/L PIO）、GW9662干預(yù)組（30 mmol/L葡萄糖+5.0 μmol/L PIO+5.0 μmol/L特異性拮抗劑GW9662）。前3組細(xì)胞分別在培養(yǎng)6、12、24、48 h時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，GW9662干預(yù)組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h時(shí)進(jìn)行檢測。采用Real- time PCR法檢測細(xì)胞中第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（PTEN）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）mRNA的表達(dá)水平;采用Western blotting法檢測細(xì)胞中PTEN、PPARγ、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、上皮鈣黏素（E-cadherin）的表達(dá)以及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路的變化。結(jié)果：隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，與正常組比較，高糖組細(xì)胞中PPARγ、PTEN mRNA及蛋白（除PPARγ 6 h外）表達(dá)水平均顯著降低，α-SMA、p-AKT（Thr308）蛋白表達(dá)水平均顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且呈時(shí)間依賴趨勢(shì);與高糖組比較，PIO組細(xì)胞中PPARγ（除6 h時(shí)的蛋白表達(dá)外）、PTEN的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，α-SMA、p-AKT（Thr308）（除6 h外）蛋白表達(dá)水平均顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著增高（P<0.05），且呈時(shí)間依賴趨勢(shì)。與高糖組比較，GW9662干預(yù)組細(xì)胞PTEN、PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平，α-SMA、E-cadherin、p-AKT（Thr308）蛋白表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PIO的作用效應(yīng)被PPARγ拮抗劑GW9662阻斷。結(jié)論：在高糖條件下PIO可能是通過激活PPARγ而實(shí)現(xiàn)對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控，使PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制，進(jìn)而抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。

關(guān)鍵詞 吡格列酮;腎小管上皮細(xì)胞;過氧化物酶體增殖物激活受體γ;第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因;磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路;上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of pioglitazone（PIO）on high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition（EMT） in renal tubular epithelial cells of rat and its possible mechanism， and to provide theoretic reference and new target for the prevention and treatment of diabetic nephropathy.? METHODS： The rat renal tubular epithelial NRK-52E cells were randomly divided into control group （5.5 mmol/L glucose）， high-glucose group （30 mmol/L glucose）， PIO intervention group （30 mmol/L glucose+5.0 μmol/L PIO）， GW9662 intervention group （30 mmol/L glucose+5.0 μmol/L PIO+5.0 μmol/L specific anta- gonist GW9662）. The cells of the first 3 groups were detected at 6， 12， 24， 48 h of culture， while those in GW9662 intervention group were detected at 48 h of culture. mRNA expression of PTEN and PPARγ were detected by real-time PCR. The protein expression of PTEN， PPARγ， α-SMA and E-cadherin as well as the changes of PI3K/AKT signaling pathway were determined by Western blotting assay. RESULTS： With the extension of culture time， compared with control group， the mRNA and protein expression of PPARγ （except for protein expression at 6 h） and PTEN in high-glucose group reduced significantly， while the protein expression of α-SMA and p-AKT（Thr308） increased significantly， and the protein expression of E-cadherin reduced significantly（P<0.05）， showing time-dependent trend. Compared with high-glucose group， the mRNA and the protein expression（except for 6 h） of PPARγ and PTEN were increased significantly in PIO intervention group， while the protein expression of α-SMA and p-AKT（Thr308） were decreased significantly， and the protein expression of E-cadherin was increased significantly （P<0.05）， showing time-dependent trend. There was no statistical significance in mRNA and protein expression of PPARγ and PTEN， protein expression of E-cadherin，α-SMA and p-AKT（Thr308） between GW9662 intervention group and high-glucose group; the effect of PIO was blocked by PPARγ antagonist GW9662. CONCLUSIONS： PIO may up-regulate the expression of PTEN by activating PPARγ， inhibit PI3K/AKT signaling pathway so as to inhibit the occurrence of EMT of renal tubular epithelial cells.

3.3.2 對(duì)蛋白表達(dá)的影響 Western blotting法結(jié)果顯示，與高糖組比較，PIO干預(yù)組細(xì)胞中PPARγ、PTEN和E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，α-SMA、p-AKT（Thr308）蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;而與高糖組比較，GW9662干預(yù)組細(xì)胞中各蛋白相對(duì)表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明PPARγ拮抗劑GW9662可以阻斷PIO的作用效應(yīng)。PIO和GW9662對(duì)高糖條件下NRK-52E細(xì)胞中PPARγ、PTEN、E-cadherin、α-SMA、p-AKT（Thr308）蛋白表達(dá)影響的電泳圖見圖3，對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響見表5。

4 討論

DN是糖尿病最常見的并發(fā)癥，主要有腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化等病理表現(xiàn)，但其發(fā)病機(jī)制中的很多具體環(huán)節(jié)目前尚不甚清楚。近年來研究認(rèn)為，腎小管間質(zhì)纖維化在DN的發(fā)生發(fā)展中具有更為重要的作用[10-11]。而已有研究表明，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化并進(jìn)一步導(dǎo)致DN腎臟損傷的主要機(jī)制是EMT[1-2]。目前認(rèn)為，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)于上皮細(xì)胞中，在EMT過程中其表達(dá)減少甚至消失，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA在EMT早期則表達(dá)增多[12]。PTEN是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有磷酸酶活性的抑癌基因，可通過負(fù)性調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)[3]。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了隨著高糖處理時(shí)間的逐漸延長，體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E中PPARγ和PTEN的mRNA及蛋白表達(dá)水平，以及上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組進(jìn)行性降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和PI3K/AKT通路因子p-AKT（Thr308）的蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組進(jìn)行性升高。這提示，PI3K/AKT信號(hào)通路可以在高糖條件下被激活，同時(shí)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN的表達(dá)較正常時(shí)明顯降低，表明腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了明顯的EMT。

噻唑烷二酮類藥物是PPARγ的選擇性激動(dòng)劑，有研究發(fā)現(xiàn)，其抗腎臟纖維化病變的機(jī)制是通過活化PPARγ 而實(shí)現(xiàn)的[9]。研究表明，PPARγ對(duì)PTEN表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制可能是其可以與位于PTEN上游的2個(gè)反應(yīng)元件直接結(jié)合[6-7]。然而，噻唑烷二酮類藥物是否通過活化PPARγ而具有上調(diào)高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞中PTEN表達(dá)的功能，從而發(fā)揮抗EMT的作用，尚未有研究闡明。本研究選用噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物PIO，通過MTT檢測顯示，PIO對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響具有雙相性，濃度為2 μmol/L時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，10 μmol/L時(shí)則抑制細(xì)胞增殖。本次試驗(yàn)選擇5 μmol/L濃度的PIO，該濃度既可對(duì)NRK-52E細(xì)胞產(chǎn)生一定抑制作用，又對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。

本研究結(jié)果顯示，PIO干預(yù)組細(xì)胞在不同作用時(shí)間（除少數(shù)時(shí)間點(diǎn)外）下，其PPARγ、PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平均較高糖組顯著升高，α-SMA和p-AKT（Thr308）蛋白表達(dá)水平均較高糖組顯著降低，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平較高糖組顯著升高，且呈時(shí)間依賴趨勢(shì)。這提示，PIO可一定程度地激活PPARγ、上調(diào)PTEN并抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的過度激活，從而表現(xiàn)出抑制NRK-52E細(xì)胞EMT發(fā)生和進(jìn)展的作用。

為了進(jìn)一步確定PIO是否通過PPARγ途徑上調(diào)PTEN來發(fā)揮抑制EMT的作用，筆者應(yīng)用PPARγ特異性拮抗劑GW9662進(jìn)行反向驗(yàn)證。GW9662能不可逆性地與PPARγ的285位半胱氨酸位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，有體外細(xì)胞試驗(yàn)已證實(shí)，1～10 μmol/L的GW9662具有特異性拮抗PPARγ活化的功能[13]。因此，選擇GW9662作為驗(yàn)證藥物來確定PIO是否通過PPARγ依賴性途徑對(duì)PTEN的表達(dá)產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，與高糖組比較，PIO確能使PPARγ和PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)水平以及E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高，使α-SMA、p-AKT（Thr308）蛋白的表達(dá)水平明顯降低;而加入PPARγ特異性拮抗劑GW9662干預(yù)后，PPARγ、PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)水平以及其余各蛋白的表達(dá)水平與高糖組均無顯著性差異，即GW9662阻斷了PIO對(duì)NRK-52E細(xì)胞的上述所有保護(hù)性作用。這進(jìn)一步明確了PIO是通過PPARγ/PTEN/PI3K/AKT通路來發(fā)揮對(duì)NRK-52E細(xì)胞發(fā)生EMT的抑制作用。

綜上，在高糖條件下PIO可能是通過激活PPARγ而實(shí)現(xiàn)對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控，使PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制，進(jìn)而抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。本研究結(jié)果可為明確DN的發(fā)病機(jī)制以及尋找DN防治的有效藥物提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-02-13 修回日期：2020-06-28）

（編輯：段思怡）