葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制劑在結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的作用

張江國(guó) 呂紅 吉明柱

[摘要] 目的 探討葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT-1）抑制劑在結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的作用。 方法 將HT29細(xì)胞分為L(zhǎng)-OHP敏感組及耐藥組，其中敏感組分為0 μM、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組，耐藥組分為0 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組。采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定耐藥及敏感結(jié)腸癌細(xì)胞系葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLUT-1）基因表達(dá)水平。用MTT法測(cè)定耐藥及敏感結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞活力。 結(jié)果 低毒濃度的L-OHP處理可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系GLUT-1表達(dá)。與L-OHP敏感細(xì)胞系細(xì)胞相比，L-OHP耐藥細(xì)胞系細(xì)胞GLUT-1表達(dá)上調(diào)。WZB117對(duì)GLUT1的抑制顯著提高了L-OHP耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。 結(jié)論 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥可能與GLUT1表達(dá)上調(diào)有關(guān)。GLUT1特異性抑制劑可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的抵抗。GLUT1可能是未來(lái)抗癌藥物發(fā)展的一個(gè)潛在目標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制劑;結(jié)腸癌細(xì)胞;奧沙利鉑;化療;耐藥

[Abstract] Objective To investigate the role of glucose transporter 1（GLUT-1） inhibitor in oxaliplatin resistance in colon cancer cell. Methods HT29 cells were divided into L-OHP sensitive group and L-OHP resistance group， among which the sensitive components were 0 μM， 4 μM， 8 μM， 16 μM， 32 μM， 64 μM L-OHP group， and the resistance components were 0 μM， 16 μM， 32 μM， 64 μM L-OHP group. Real-time polymerase chain reaction（PCR） and Western blot were used to determine the expression level of glucose transporter-1（GLUT-1） gene in drug-resistant and sensitive colon cancer cells. The cell viability of drug-resistant and sensitive colon cancer cell lines was determined by MTT method. Results L-OHP treatment with low toxic concentration can induce the expression of colon cancer cell line GLUT-1. Compared with that of L-OHP sensitive cell line cells， the expression of GLUT-1 in L-OHP resistant cell line cells was up-regulated. The inhibition of GLUT1 by WZB117 significantly increased the sensitivity of L-OHP resistant cells to drugs. Conclusion The resistance of colon cancer cells to L-OHP may be related to the up-regulation of GLUT1 expression. GLUT1 specific inhibitors can reverse the resistance of colon cancer cells to L-OHP. GLUT1 may be a potential target for the development of anticancer drugs in the future.

[Key words] Glucose transporter type 1; Glucose transporter type 1 inhibitor; Colon cancer cells; Oxaliplatin; Chemotherapy; Drug resistance

結(jié)腸癌的化療作為手術(shù)切除腫瘤后的輔助治療手段，可以有效殺滅微小腫瘤灶及轉(zhuǎn)移灶，明顯提高術(shù)后無(wú)病生存率及延長(zhǎng)總生存期。新一代化療藥物奧沙利鉑使得輔助化療上了一個(gè)新臺(tái)階。它是第三代鉑類(lèi)抗癌藥物，藥理學(xué)特性和其他鉑類(lèi)藥物相似，均以DNA為靶點(diǎn)。L-OHP的耐藥問(wèn)題目前也已成為困擾臨床醫(yī)生的一大難題，其耐藥機(jī)制為DNA損傷修復(fù)、藥物解毒增加、藥物積聚減少、Fas相關(guān)磷酸酶-1表達(dá)上調(diào)等[1]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）是細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的葡萄糖以易化擴(kuò)散的方式相互轉(zhuǎn)運(yùn)。GLUT-1蛋白質(zhì)是一種高度疏水的、糖基化程度各異的蛋白質(zhì)，在缺氧及缺血的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，主要參與細(xì)胞基礎(chǔ)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞能量代謝中起到極其重要作用。癌細(xì)胞主要依賴(lài)于葡萄糖提供能量，因此癌細(xì)胞對(duì)于葡萄糖剝奪敏感[2]。腫瘤細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加主要是由于其細(xì)胞膜上GLUT-1上調(diào)所致，通過(guò)shRNA敲除GLUT-1基因可以增加頭頸部腫瘤對(duì)化療藥物順鉑的敏感性[3]，抑制GLUT1表達(dá)可增加結(jié)腸癌細(xì)胞的敏感性[4，5]，提示GLUT1有可能成為克服化療藥物耐藥的靶標(biāo)之一。WZB117是一種新型的GLUT-1不可逆性抑制劑，可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的攝入量及ATP水平，進(jìn)而抑制糖酵解并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。最近有報(bào)道指出WZB117刺激癌細(xì)胞可致GLUT-1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，進(jìn)而引起AMP激活的蛋白激酶的增加、細(xì)胞周期蛋白E2以及磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑癌蛋白下降，導(dǎo)致癌細(xì)胞周期停滯，衰老和壞死[6]。WZB117能夠通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞膜上的GLUT-1進(jìn)而克服癌細(xì)胞對(duì)5氟尿嘧啶的耐藥性[7]。

本研究擬對(duì)GLUT1和GLUT1抑制劑WZB117在逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP耐藥性中的作用進(jìn)行相關(guān)研究，明確其在L-OHP耐藥性中的作用，為將來(lái)在耐化療藥的結(jié)腸癌靶向治療中提供新的武器。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，樂(lè)沙定（注射用L-OHP）購(gòu)自比利時(shí)Laboratoires Thissen公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、新生小牛血清、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，MTT試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，一步法Realtime RT-PCR試劑購(gòu)自上海羽朵生物公司，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物公司，抗GLUT1抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司，WZB117購(gòu)自Sigma-aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioTek ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，iCycler熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 L-OHP耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞系的建立? 將人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞放置于含有濃度依次增加的L-OHP的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，起始的L-OHP的濃度定為HT29細(xì)胞經(jīng)MTT法檢測(cè)在540 nm波長(zhǎng)光測(cè)定時(shí)吸光度減半時(shí)的濃度，后每2周濃度增加10%，挑出對(duì)L-OHP耐藥的單個(gè)克隆的結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所有耐藥細(xì)胞均每4周重復(fù)進(jìn)行L-OHP刺激，使用該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)[8]。將上述細(xì)胞分為L(zhǎng)-OHP敏感組及耐藥組，其中敏感組分為0 μM、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組，耐藥組分為0 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定GLUT-1基因表達(dá)水平? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥株和敏感株HT29細(xì)胞，引物探針為Glut1：Forward：5-AACTCTTCAGCCAGGGTCCAC-3，Reverse：5-CA-CAGTGAAGATGATGAAGAC-3，采用RNA提取試劑盒提取，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件為：37℃反轉(zhuǎn)錄1 h，85℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min。反轉(zhuǎn)錄后模板用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析[7]。

1.3.3 Western blot測(cè)定GLUT-1蛋白表達(dá)水平? 收集敏感腫瘤細(xì)胞系和耐藥腫瘤細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗后加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4℃ 12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后吸取上清，加1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液并100℃變性10 min。以20～30 μg的蛋白量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)使蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，加入抗GLUT1抗體，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，均勻滴加ECL發(fā)光液后用Bio-Rad凝膠成像儀顯影[7]。Image J軟件進(jìn)行圖片條帶灰度值分析。

1.3.4 MTT法測(cè)定L-OHP及WZB117對(duì)敏感及耐藥腫瘤細(xì)胞系活性的影響? 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞，將其制備成105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。分別予100 μL接種于96孔板各孔中，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分組，加入不同濃度的藥物100 μL，每孔終體積為200 μL。各濃度各設(shè)18個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h，在對(duì)照孔細(xì)胞達(dá)到90%融合后，在各孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 150 μL，室溫下震蕩10～15 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)吸光度值。重復(fù)3次。細(xì)胞活性=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L-OHP誘導(dǎo)HT29細(xì)胞GLUT-1的表達(dá)

本研究分析了L-OHP作用HT29細(xì)胞后GLUT-1的表達(dá)情況。在低濃度的L-OHP處理24 h后，檢測(cè)HT-29細(xì)胞中GLUT1的表達(dá)。如表1所示（2-△△Ct法），L-OHP 4 μM時(shí)，GLUT1的mRNA表達(dá)表達(dá)量是空白對(duì)照組的（1.45±0.26）倍;L-OHP 8 μM時(shí)，GLUT1的mRNA表達(dá)量是空白對(duì)照組的（2.07±0.22）倍;L-OHP 16μM時(shí)，GLUT1的mRNA表達(dá)量是空白對(duì)照組的（4.99±0.91）倍，較對(duì)照組（未受L-OHP作用的HT-29細(xì)胞）明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)圖1。L-OHP 0uM時(shí)HT-29細(xì)胞GLUT1相對(duì)蛋白表達(dá)量為（0.28±0.02）。4 μM、8 μM、16 μM時(shí)，HT-29細(xì)胞GLUT1的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.83±0.04）、（1.55±0.55）、（1.72±0.11），較0 μM時(shí)明顯增加（P<0.05）。隨著L-OHP的濃度增加（最高濃度增加至16 μM），HT-29細(xì)胞的GLUT1水平明顯增加，且GLUT1表達(dá)呈L-OHP劑量依賴(lài)性模式。上述結(jié)果提示L-OHP作用于HT-29細(xì)胞可誘導(dǎo)GLUT1表達(dá)增加。見(jiàn)表1。

2.2 L-OHP敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中GLUT1的表達(dá)

為了明確GLUT1在HT-29細(xì)胞對(duì)L-OHP耐藥中的作用，分別檢測(cè)L-OHP敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中GLUT1的表達(dá)。如表2、圖2所示，16 μM L-OHP作用于耐藥細(xì)胞株的GLUT1 mRNA表達(dá)水平是敏感組的（4.430±0.684）倍，耐藥細(xì)胞株的GLUT1 mRNA表達(dá)較敏感細(xì)胞株明顯升高（P<0.05）。敏感細(xì)胞株的GLUT1 蛋白相對(duì)表達(dá)量是（0.35±0.03），耐藥細(xì)胞株的GLUT1蛋白相對(duì)表達(dá)量是（0.94±0.02），與敏感細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株的GLUT1蛋白水平明顯升高（P<0.05）。

2.3 L-OHP對(duì)敏感和耐L-OHP的HT-29細(xì)胞系細(xì)胞活性的影響

為了明確GLUT1表達(dá)增加是否是L-OHP耐藥的主要機(jī)制，本研究從HT-29細(xì)胞系中選擇L-OHP耐藥細(xì)胞。按照向征等[8]的方法建立耐L-OHP的HT-29細(xì)胞系，檢測(cè)不同濃度（0 μM、16 μM、32 μM、64 μM的L-OHP）作用72 h后L-OHP敏感HT-29細(xì)胞系和L-OHP耐藥HT-29細(xì)胞系細(xì)胞活性。如表3所示，16 μM L-OHP時(shí)敏感株及耐藥株的細(xì)胞活性分別為（0.79±0.05）和（0.89±0.02），32 μM L-OHP時(shí)敏感株及耐藥株的細(xì)胞活性分別為（0.58±0.04）和（0.87±0.02），64 μM L-OHP時(shí)敏感株及耐藥株的細(xì)胞活性分別為（0.31±0.05）和（0.74±0.01），L-OHP耐藥細(xì)胞株接受相同濃度的L-OHP作用后其活性較敏感細(xì)胞株明顯升高（P<0.05），提示耐藥細(xì)胞株對(duì)L-OHP耐藥。

2.4 L-OHP和WZB117對(duì)耐藥HT-29細(xì)胞系活性的影響

GLUT-1特異性抑制劑WZB117能有效抑制GLUT-1的表達(dá)，下調(diào)糖酵解，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。如表4所示，用L-OHP、WZB117及L-OHP和WZB117聯(lián)合作用于L-OHP耐藥細(xì)胞株。16 μM L-OHP作用的耐藥株的細(xì)胞活性為（0.86±0.03），5 μM WZB117作用的耐藥株的細(xì)胞活性為（0.75±0.01），16 μM L-OHP和5 μM WZB117聯(lián)合作用的耐藥株的細(xì)胞活性為（0.46±0.02），這表明L-OHP和GLUT-1抑制劑WZB117聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用上述任何一種藥物（P<0.01）。WZB117對(duì)GLUT-1的抑制顯著提高了L-OHP對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制作用。GLUT-1可能是克服結(jié)腸癌L-OHP耐藥的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

3 討論

L-OHP常用于結(jié)直腸癌的化療，癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)L-OHP的耐藥性是化療失敗的常見(jiàn)原因。常見(jiàn)L-OHP的耐藥機(jī)制為DNA損傷修復(fù)、藥物解毒增加、藥物積聚減少、Fas相關(guān)磷酸酶-1表達(dá)上調(diào)等[1]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，隨著L-OHP的濃度增加，HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的GLUT-1水平明顯增加，且GLUT-1表達(dá)呈L-OHP劑量依賴(lài)性模式。GLUT-1高表達(dá)的HT-29細(xì)胞耐藥株在多重濃度的L-OHP下表現(xiàn)出更強(qiáng)的存活能力。參與葡萄糖代謝的GLUT-1高表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP耐藥，這可能是結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP耐藥的一種新的機(jī)制。

L-OHP作用于HT-29細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）約為32 μM，因此本研究檢測(cè)了0 μM、8 μM、16 μM的L-OHP作用于HT-29細(xì)胞后GLUT-1基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在L-OHP16 μM時(shí)的GLUT-1的表達(dá)量最高，和汪峰等的研究結(jié)果相似，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇16 μM L-OHP作用于敏感及耐藥細(xì)胞株[9]。

Warburg效應(yīng)是指與正常的細(xì)胞相比，癌細(xì)胞更喜歡利用有氧糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化來(lái)產(chǎn)生能量[10]。通過(guò)增強(qiáng)Warburg效應(yīng)可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而抑制Warburg效應(yīng)可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11-13]。參與癌細(xì)胞有氧糖酵解的GLUT-1表達(dá)增加促進(jìn)癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[14，15]，而GLUT-1特異性抑制劑WZB117通過(guò)抑制癌細(xì)胞膜GLUT-1的活性進(jìn)而耗盡細(xì)胞內(nèi)的ATP從而使細(xì)胞發(fā)生衰老和壞死[6]。Liu W等[7]研究也發(fā)現(xiàn)WZB117能有效抑制5氟尿嘧啶耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞GLUT-1的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用。為了進(jìn)一步明確GLUT-1在L-OHP耐藥中的作用，本研究進(jìn)行了L-OHP和WZB117對(duì)耐藥HT-29細(xì)胞系活性影響的實(shí)驗(yàn)。和上述結(jié)果相似，本研究首次觀察到L-OHP和WZB117聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，其可能的機(jī)制為WZB 117抑制GLUT-1的活性，進(jìn)而抑制Warburg效應(yīng)而逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥性。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥可能與GLUT-1表達(dá)上調(diào)有關(guān)，而GLUT-1特異性抑制劑可逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥性。GLUT-1可能是未來(lái)抗癌藥物發(fā)展的潛在靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-02-17）