四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria ribis室內(nèi)毒力測(cè)定及其田間防效試驗(yàn)

郭春麗， 趙新海

(1.遼寧微科生物工程股份有限公司，遼寧 朝陽(yáng) 122000;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

楊樹是人造木板和纖維用材的主要加工原料，同時(shí)對(duì)植樹造林、生態(tài)恢復(fù)、風(fēng)景綠化和防風(fēng)固沙具有重要作用。我國(guó)是世界上楊樹人工林面積最大的國(guó)家，但多種病蟲害的發(fā)生制約了楊樹林產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的導(dǎo)致楊樹病害的病原菌種類達(dá)300多種，其中茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeriaribis引起的楊樹潰瘍病危害較重[2-5]，在我國(guó)各地普遍發(fā)生。楊樹潰瘍病菌為弱寄生菌，寄主范圍非常廣泛，具潛伏侵染特性，發(fā)展速度快，分布面積廣，危害日趨嚴(yán)重，防治難度大[6]，已成為發(fā)展我國(guó)楊樹人工林的嚴(yán)重障礙，制約我國(guó)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展[7]。目前在防治楊樹潰瘍病方面主要采用楊樹抗?jié)儾∮N和藥劑防治兩種方法進(jìn)行[8-9]。 四霉素是不吸水鏈霉菌梧州亞種的代謝產(chǎn)物[10]，主要有效成分包括A1、A2、B和C四大組分，其中A1和 A2兩個(gè)組分屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類四烯抗菌素；B組分為白諾氏菌素 (Albonoursin)，屬于環(huán)肽類抗菌素； C組分為茴香霉素 (Anisomyein)，屬于含氮雜環(huán)類、芳香族衍生物類抗菌素。大量研究表明四霉素對(duì)多種植物病原菌有較高的抑制活性[11-12]，是一種高效低毒的生物農(nóng)藥，在林業(yè)病害防治應(yīng)用中對(duì)多種林木腐爛病、潰瘍病、黑斑病具有良好防治效果[13-15]，具有促進(jìn)患病部位愈合、弱苗根系生長(zhǎng)、老化根系再生、提高作物自身抗病力等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定四霉素對(duì)楊樹潰瘍病菌的室內(nèi)活性，通過(guò)刮治噴涂法進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，旨在為進(jìn)一步明確四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌的抑菌效果及對(duì)其導(dǎo)致的楊樹潰瘍病防治效果，從而為規(guī)?；乐螚顦錆儾√峁?shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeriaribis，遼寧省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 供試樹種 銀中楊。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)切塊200 g，煮沸20 min，過(guò)濾留取汁液，加入葡萄糖20 g，瓊脂18 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min，冷卻備用。

1.1.4 供試藥劑 ①試驗(yàn)藥劑：15%四霉素母液(tetra mycin)、0.3%四霉素水劑，均由遼寧微科生物工程股份有限公司制備;②對(duì)照藥劑：10%多抗霉素(polyoxin) B可濕性粉劑，陜西先農(nóng)生物科技有限公司生產(chǎn)，市售。

1.1.5 器械 壁紙刀，背負(fù)式噴霧器，毛刷，自噴漆。

1.1.6 試驗(yàn)地基本情況 試驗(yàn)地點(diǎn)位于錦州市凌海三臺(tái)子鎮(zhèn)四豐村，該地區(qū)楊樹潰瘍病病原以茶藨子葡萄座腔菌為主；試驗(yàn)面積15 hm2，樹齡8 a，行距4 m×3 m，土壤類型為壤土，pH 7.1；水肥條件良好，中等管理水平。施藥當(dāng)日(2018年5月3日)天氣晴，最高氣溫20 ℃，最低氣溫8 ℃，施藥后7 d內(nèi)無(wú)降雨。

1.2 方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定 ①病原菌菌種培養(yǎng):將茶藨子葡萄座腔菌接種于PDA培養(yǎng)基上，(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)72 h備用。②藥劑濃度的配制：依據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，分別將15%四霉素和10%多抗霉素B可濕性粉劑稀釋至設(shè)置濃度(表1)，待用。

表1 試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)

③含藥培養(yǎng)基平板的制備：每個(gè)500 mL三角瓶中定量加入100 mL PDA培養(yǎng)基，滅菌后備用。將培養(yǎng)基融化冷卻至50 ℃左右，無(wú)菌條件下，在裝有100 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中加入1 mL表1設(shè)置濃度的藥劑，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，制成相應(yīng)濃度的帶藥培養(yǎng)基平板，設(shè)不加藥劑的PDA培養(yǎng)基平板作為對(duì)照(含等量無(wú)菌水)。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。為保證供試病菌的菌齡相同，使用直徑為4 mm打孔器(已滅菌)將事先制備的茶藨子葡萄座腔菌平板沿菌落邊緣打成菌餅，無(wú)菌條件下，將菌餅轉(zhuǎn)接至各處理含藥培養(yǎng)基中央，菌絲面朝上，(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)。根據(jù)對(duì)照平板菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各藥劑處理組菌落直徑。按公式(1)、(2)計(jì)算各處理濃度對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)，計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。

A=A1-A2………………………………(1)

式中，

A：菌落增長(zhǎng)直徑；

A1：菌落直徑；

A2：菌餅直徑。

式中，

C：菌絲生長(zhǎng)抑制率；

B1：空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑；

B2：藥劑處理菌落增長(zhǎng)直徑。

④統(tǒng)計(jì)分析方法:將抑菌率換算成抑制率的機(jī)率值，以各處理濃度的對(duì)數(shù)為x值，以相應(yīng)處理對(duì)菌絲的抑制率的機(jī)率值為y值，用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法求出供試藥劑的毒力回歸方程y=ax+b，并以y=5(抑菌率為50%的機(jī)率值)帶入回歸方程，求出EC50(抑制中濃度)、EC90值。

1.2.2 田間防效試驗(yàn) ①藥劑用量與處理：田間防治使用0.3%四霉素水劑，對(duì)照藥劑選擇10%多抗霉素(polyoxin) B可濕性粉劑。試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理，即0.3%四霉素水劑10倍稀釋液、0.3%四霉素水劑30倍稀釋液、0.3%四霉素水劑50倍稀釋液、10%多抗霉素(polyoxin) B可濕性粉劑500倍稀釋液、10%多抗霉素(polyoxin) B可濕性粉劑1 000倍稀釋液、對(duì)照CK噴施清水。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，共計(jì)18個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)20 m×25 m，內(nèi)有5～6棵感病楊樹。②施藥方法：確定試驗(yàn)小區(qū)劃分后，用自噴漆將患病楊樹進(jìn)行標(biāo)記。按各處理濃度配置好藥劑，施藥前用壁紙刀將感病部位的樹皮削掉，露出未感染的組織，用毛刷將供試藥劑涂抹至患病處，每處反復(fù)涂抹5次，每次間隔5～10 min。③調(diào)查與防效計(jì)算方法：于施藥前2d(2018年5月1日)進(jìn)行病情基數(shù)調(diào)查，于施藥后20 d(2018年5月23日)進(jìn)行防效調(diào)查。調(diào)查方法采用數(shù)測(cè)調(diào)查法，在施藥前調(diào)查記錄各小區(qū)感病疤塊基數(shù)，用紅色蠟筆劃定感病區(qū)域；施藥20 d后，調(diào)查各試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)施藥楊樹上病疤數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總后，計(jì)算防效。

2 結(jié)果與分析

2.1 四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌的抑菌效果，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，供試藥劑四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌的抑制率隨有效成分濃度增高而增高，呈明顯正相關(guān)的線性關(guān)系，經(jīng)回歸分析，求得回歸方程為y=2.434 4x-0.021 7,r值為0.999 5。其對(duì)茶藨子葡萄座腔菌的EC50、EC90分別為114.82 a.i.mg/L、389.05 a.i.mg/L，對(duì)照藥劑多抗霉素的EC50、EC90分別為134.89 a.i.mg/L、489.78 a.i.mg/L，與對(duì)照藥劑多抗霉素相比，四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌的抑菌活性略高。

表2 四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌毒力測(cè)定結(jié)果

2.2 田間防效試驗(yàn)結(jié)果

采用刮治噴涂法，使用0.3%四霉素水劑對(duì)茶藨子葡萄座腔菌引起的楊樹潰瘍病進(jìn)行田間防治效果試驗(yàn)(見表4)，試驗(yàn)結(jié)果表明，0.3%四霉素水劑各濃度處理對(duì)楊樹潰瘍病均具有較好的防治效果，防效達(dá)68.25%～82.41%，略優(yōu)于對(duì)照藥劑10%多抗霉素對(duì)應(yīng)濃度處理的防治效果。

表4 四霉素防治楊樹潰瘍病田間藥效試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

四霉素作為一種廣譜的生物農(nóng)藥，近年來(lái)應(yīng)用范圍不斷拓展，研究表明四霉素對(duì)細(xì)菌性楊樹潰瘍病具有較好防治效果，已在多地開展防效試驗(yàn)，并在實(shí)際應(yīng)用中取得較好效果[14-16]。為進(jìn)一步挖掘四霉素在林業(yè)生物防治中的應(yīng)用潛力，開展了四霉素對(duì)楊樹潰瘍病病原真菌茶藨子葡萄座腔菌的室內(nèi)毒力測(cè)定和田間防效試驗(yàn)，結(jié)果表明四霉素對(duì)茶藨子葡萄座腔菌具有較強(qiáng)抑菌效果，EC50和EC90分別為114.82 a.i.mg/L、389.05a.i.mg/L，田間防效達(dá)68.25%～82.41%，四霉素對(duì)真菌引起的楊樹潰瘍病也具有較好防效。多種病原菌可以導(dǎo)致楊樹潰瘍病，按病原物類型可以分為細(xì)菌和真菌[17-18]，而不同種類的病原菌在防治時(shí)用藥類型不同，在實(shí)際生產(chǎn)中往往需要對(duì)病原菌精準(zhǔn)診斷后，有針對(duì)性用藥才能達(dá)到較好的防治效果，而四霉素可以有效防治細(xì)菌和真菌引起的楊樹潰瘍病，在林業(yè)病害生物防治中應(yīng)用前景廣闊。