血吸蟲感染通過抑制前炎癥免疫應(yīng)答緩解實(shí)驗(yàn)性腦瘧的發(fā)生

馮永輝， 曹雅明， 朱曉彤

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110001; 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

2017年WHO瘧疾全球報(bào)告[1]指出：截至2016年底，全球91個(gè)國(guó)家和地區(qū)約一半人口受到瘧疾威脅，其中2.16億人發(fā)病，44.5萬人死亡，死亡人群絕大多數(shù)是5歲以下兒童。腦瘧(cerebral malaria, CM)所引起的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥是引起5歲以下兒童死亡的主要原因。盡管CM發(fā)生的具體機(jī)制仍未完全清楚，但瘧原蟲感染的紅細(xì)胞在腦部血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的沉積是腦瘧發(fā)生的主要先前因素；同時(shí)宿主免疫應(yīng)答的失調(diào)會(huì)進(jìn)一步加劇腦瘧的發(fā)生：過度的前炎癥免疫應(yīng)答(尤其是Th1型免疫應(yīng)答)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集和紅細(xì)胞、血小板的黏附聚集，引起腦組織微血管的堵塞和腦組織缺血，從而誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生一系列癥狀[2]。利用PbANKA感染C57 BL/6小鼠所建立的實(shí)驗(yàn)性腦瘧(experimental cerebral malaria, ECM)模型能模擬腦瘧發(fā)生過程中的宿主免疫應(yīng)答，常用于評(píng)價(jià)腦瘧的免疫應(yīng)答水平[3]。在瘧疾流行區(qū)，瘧疾患者常常伴隨有蠕蟲感染[4]，但關(guān)于混合感染的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，主要因?yàn)椴煌芯克捎玫男∈笃废怠懺x蟲株，感染途徑不同所致[5]。蠕蟲反復(fù)感染常常會(huì)改變宿主的免疫應(yīng)答水平，促使機(jī)體產(chǎn)生顯著的Th2免疫應(yīng)答[6]。Th1和Th2免疫應(yīng)答的平衡對(duì)于瘧疾控制至關(guān)重要。而在瘧疾感染過程中，DCs等固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答在平衡Th1和Th2免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用[7]。因此采用血吸蟲感染模型和ECM模型來探討日本血吸蟲感染對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧的緩解作用，明確固有免疫應(yīng)答在此過程中的重要作用，從而為瘧疾流行區(qū)蠕蟲混合感染的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及蟲株 3～4周齡，雌性C57 BL/6小鼠，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。日本血吸蟲蟲株(Schistosomajaponicum)購(gòu)自江蘇血吸蟲病研究所(無錫)，PbANKA由日本愛嬡大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 以下抗體均購(gòu)自BD PharMingen或eBiosciences：抗-CD4-FITC單克隆抗體(GKl.5；BD Pharmingen)、抗-CD25-PE單克隆抗體(PC61；BD Pharmingen)、抗-Foxp3-APC單克隆抗體(clone FJKl6s；eBioscience)、抗FcγIII/II封閉抗體(2.4G2；BD Pharmigen)、抗-CDllc-FITC單克隆抗體(HL3；BD Pharmigen)、抗-CDllb-PE單克隆抗體(M1/70；BD Pharmigen)，抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體(RA3.682；BDPharmigen)、抗-CD86-PE單克隆抗體(GLl；BD Pharmigen)、抗-MHC II-PE單克隆抗體(M5/115.15.2；BD Pharmigen)、抗-TLR4-PE單克隆抗體(MTS510；BD Pharmigen)、抗-TLR9-PE單克隆抗體(5G5；HBT)、抗-F4/80-FITC單克隆抗體(T45-2342；BD Pharmigen)和抗CD36-PE單克隆抗體(CRF D-2712；BD Pharmigen)。IFN-γ、TNF-α、IL-10細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)自R&D公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibuler, USA)，酶標(biāo)儀(BioRad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒓疤幚?雌性C57 BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：正常組(Normal)、感染對(duì)照組(Pb)、血吸蟲組(Schistosoma)和混合感染(Schistosoma+Pb)組。Schistosoma組和Schistosoma+Pb組小鼠在感染PbANKA前8周經(jīng)尾靜脈注射50條血吸蟲尾蚴。然后在第0天，感染對(duì)照組和混合感染組小鼠經(jīng)腹腔分別感染1×106PbANKA寄生紅細(xì)胞，建立ECM模型，Normal組小鼠不做任何處理。感染后不同時(shí)間，小鼠尾靜脈取血，鏡檢計(jì)數(shù)紅網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞感染率，并每日觀察生存率。

1.2.2 脾臟流式細(xì)胞術(shù) 無菌取出感染后第5天小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液[8]，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體、抗-CD45R/B220-PerCP和抗-CD86-APC單克隆抗體進(jìn)行四色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體、抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體和抗-CD86-APC單克隆抗體進(jìn)行表面染色。離心去上清后，用0.5 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗TLR4-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。每份樣品用抗-CD11c-FITC單抗進(jìn)行雙色分析, 另設(shè)陰性對(duì)照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，按試劑說明書所示，進(jìn)行固定和透膜后，再分別加入生物素標(biāo)記的抗-TLR9單抗和PE-streptavidin。每份樣品用抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗CD36-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，再加入抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗CD36-PE單克隆抗體進(jìn)行表面染色。每份樣品用抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE和抗-Foxp3-APC單抗進(jìn)行三色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，用抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE進(jìn)行表面染色，固定透膜后，用抗-Foxp3-APC單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色。采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，用Flowjo進(jìn)行分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，3組樣本之間采用方差分析比較均值差異，采用Kaplan-Meyer方法進(jìn)行生存期分析。P< 0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本血吸蟲感染對(duì)小鼠體重、感染率和生存期的影響

C57小鼠感染血吸蟲1個(gè)月后，建立ECM模型。如圖1A與1B所示，在感染后第9天，混合感染組小鼠的原蟲血癥水平顯著低于感染對(duì)照組(P<0.05)，隨后2組小鼠的原蟲血癥水平均逐漸上升，最后死于貧血。在第6～11天，70%(7/10)感染對(duì)照組小鼠出現(xiàn)腦瘧典型癥狀并死于ECM，并于感染后19 d內(nèi)全部死亡；混合感染組小鼠30%(3/10)出現(xiàn)腦瘧典型癥狀并死于ECM，所有小鼠于感染后第23天全部死亡，2組生存期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)還監(jiān)測(cè)了2組小鼠的體重變化，圖1C顯示感染對(duì)照組小鼠的體重從感染后第7天開始持續(xù)下降，在第5天和第9天，混合感染組小鼠的體重顯著高于感染對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 日本血吸蟲感染抑制ECM模型小鼠脾臟DC的分化和活化

DC分為髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)和漿樣樹突狀細(xì)胞(pDC)兩種，在抗瘧保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，尤其是mDC的數(shù)量和功能分子表達(dá)水平的高低對(duì)ECM的進(jìn)展至關(guān)重要[9]。首先檢測(cè)了混合感染對(duì)ECM模型DC亞群數(shù)量的影響。如圖2A所示，在感染后第5天，血吸蟲感染和/或PbANKA感染能顯著增加DC及其亞群的比例，與感染對(duì)照組相比，混合感染組小鼠脾臟中mDCs(CD11c+CD11b+)和pDCs(CD11c+CD45R/B220+)的比例未見顯著差異；但混合感染能顯著降低小鼠脾臟中mDCs和pDCs的數(shù)量(如圖2B、2C、2D所示)。此外，還通過FACS檢測(cè)了各組小鼠DC的CD86、TLR4和TLR9分子表達(dá)水平(如圖2E、2F、2G所示)，結(jié)果顯示日本血吸蟲混合感染均能降低PbANKA感染小鼠這三種分子的表達(dá)水平，與感染對(duì)照組相比，TLR9分子的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。

圖1 日本血吸蟲感染對(duì)小鼠體重、感染率和生存期的影響Fig.1 The effect of co-infection on the bodyweight, parasitemia and survival of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：感染率；B：生存率；C：體重變化;與Pb 相比，*：P<0.05 A: Parasitemia; B: Survival rate; C: Body weight change;* represent P<0.05 compared with Pb group

圖2 日本血吸蟲感染抑制ECM模型小鼠脾臟DC的分化和活化Fig.2 Co-iinfection inhibited the differentiation and activation of DC from the spleen of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：DC亞群流式結(jié)果；B：DC總數(shù)；C：髓樣DC總數(shù)；D：漿樣DC總數(shù)；E：CD86表達(dá)水平；F：TLR4表達(dá)水平；G：TLR9表達(dá)水平;與Pb組相比，*：P< 0.05，**：P< 0.01，***：P< 0.001,下圖同A: FACS results of DC; B: total DCs; C: total myeloid DCs; D: total plasmacytoid DCs; E: MFI of CD86; F: MFI of TLR4; G: DCs expressing TLR9; *， ** and*** represent P< 0.05, P< 0.01 and P< 0.001 compared with Pb group, respectively，same the follow

2.3 日本血吸蟲感染抑制ECM小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的活化和增殖

2.4 混合感染對(duì)ECM前炎癥細(xì)胞因子的影響

在小鼠感染后第0、3、5和8天，檢測(cè)了Pb組、Schistosoma組和Pb+Schistosoma組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ水平。結(jié)果顯示(圖4)，Schistosoma組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IFN-γ的水平在感染后第0～8天未見顯著變化。Pb+Schistosoma組和Pb組脾上清中TNF-α水平在第3天顯著升高，隨后下降(兩組相比，P<0.01)；同時(shí)兩組IFN-γ和TNF-α水平在感染后第3天和第5天顯著升高(兩組相比，P<0.01)，隨后下降。

2.5 血吸蟲混合感染對(duì)脾臟Treg的影響

Treg作為平衡體內(nèi)前炎癥免疫應(yīng)答的一群重要細(xì)胞，在調(diào)控ECM的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11]。為此檢測(cè)了脾臟中Treg的數(shù)量和功能因子IL-10的表達(dá)水平。從圖5中可以看出，血吸蟲和/或PbANKA感染會(huì)誘導(dǎo)脾細(xì)胞中Treg的數(shù)量顯著升高(與正常鼠相比，P<0.05)，與Pb組相比，混合感染會(huì)增加Treg的數(shù)量；血吸蟲感染會(huì)顯著提高脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-10水平(與正常鼠相比，P<0.05)。

圖3 日本血吸蟲感染抑制ECM小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的活化和增殖Fig.3 Co-infection inhibited the activation and proliferation of macrophages from the spleen of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：活化巨噬細(xì)胞的流式結(jié)果；B：巨噬細(xì)胞總數(shù)；C：NO分泌水平 A: FACS results of activated macrophages; B: total macrophages; C: secreted NO level

圖4 混合感染對(duì)前炎癥細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effect of co-infection on the pro-inflammatory cytokinesA：TNF-α表達(dá)水平；B：IFN-γ表達(dá)水平 A: TNF-α levels; B: IFN-γ levels

圖5 日本血吸蟲感染上調(diào)ECM小鼠脾臟Treg的數(shù)量和功能Fig.5 Co-infection increased the proliferation and function of Treg from the spleen of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：Treg流式結(jié)果；B：Treg總數(shù)；C：IL-10表達(dá)水平A: Facs results of Treg; B: total Tregs; C: IL-10 levels

3 討 論

瘧疾作為世界三大致死性疾病之一，嚴(yán)重威脅居住在熱帶和亞熱帶的居民，其中血吸蟲病與瘧疾混合感染的流行并行尤為常見[12]。目前關(guān)于血吸蟲與瘧原蟲混合感染對(duì)于宿主免疫應(yīng)答的文獻(xiàn)報(bào)道較少，同時(shí)不同種屬的血吸蟲與不同種屬的瘧原蟲混合感染所引起的感染結(jié)局不盡相同。有研究認(rèn)為曼氏血吸蟲與伯氏瘧原蟲混合感染C57BL/6小鼠，對(duì)ECM有保護(hù)作用[13]；而在Swiss albino小鼠模型中的混合感染會(huì)引起原蟲血癥和死亡率顯著升高[14]。目前關(guān)于血吸蟲與瘧原蟲混合感染對(duì)宿主免疫的影響主要集中于適應(yīng)性免疫應(yīng)答，而對(duì)于調(diào)控Th1/Th2免疫應(yīng)答至關(guān)重要的固有免疫應(yīng)答的報(bào)道較少。為此，本研究通過建立日本血吸蟲與ECM模型來探討混合感染對(duì)宿主固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的前炎癥免疫應(yīng)答(包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量及其相關(guān)功能分子)的影響。結(jié)果顯示，日本血吸蟲感染會(huì)通過抑制宿主前炎癥免疫應(yīng)答來緩解實(shí)驗(yàn)性腦瘧的發(fā)生。

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)在誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用，成熟的DCs是活化初始T細(xì)胞的重要抗原提呈細(xì)胞，能誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1/Th2/Treg/Th17等不同的亞群分化。DCs作為固有免疫系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞亞群，其亞群的分化及功能分子的表達(dá)水平會(huì)影響后續(xù)的Th1/Th2免疫應(yīng)答形式和強(qiáng)度。DC能直接識(shí)別并提呈瘧原蟲抗原給CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主建立抗原特異性的免疫應(yīng)答[15]。本研究通過FACS檢測(cè)了脾臟中兩種重要的DC亞群(mDC和pDC)，結(jié)果顯示日本血吸蟲感染會(huì)降低兩種DC亞群的數(shù)量，尤其是能夠極化Th1免疫應(yīng)答的mDC數(shù)量；CD86作為DC成熟重要標(biāo)志之一，其表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)DC的提呈，瘧疾感染過程中，瘧原蟲會(huì)通過TLR4和TLR9上調(diào)趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)宿主的前炎癥應(yīng)答水平，提示日本血吸蟲感染會(huì)降低DC功能分子如CD86、TLR4和TLR9的表達(dá)水平，從而抑制DC的成熟和活化。

NO是在病原體感染時(shí)主要由iNOS產(chǎn)生，由IFN-γ和TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[16]。NO在CM進(jìn)展過程中的作用存在爭(zhēng)議[17]。有研究認(rèn)為感染早期脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中高水平的NO能夠抵抗瘧疾感染[18]。但也有研究表明NO有助于CM病理發(fā)生，體內(nèi)低水平NO 與CM內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和損傷有關(guān)[19]：NO水平降低會(huì)通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化和白細(xì)胞及血小板的沉積來介導(dǎo)血管破壞及降低血流速度。我們檢測(cè)了活化巨噬細(xì)胞的數(shù)量和功能，結(jié)果提示血吸蟲感染會(huì)抑制PbANKA感染引起的巨噬細(xì)胞活化和增殖，從而抑制宿主體內(nèi)過強(qiáng)的前炎癥免疫應(yīng)答，從而緩解ECM的發(fā)生。

Treg作為體內(nèi)平衡Th1/Th2免疫應(yīng)答最重要的免疫細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)Treg會(huì)通過改變前炎癥免疫應(yīng)答(IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17和 NO)和抗炎癥免疫應(yīng)答(IL-10)的平衡來決定ECM的結(jié)局[11,20]。血吸蟲感染會(huì)增加宿主體內(nèi)Treg的數(shù)量，并抑制體內(nèi)Th1免疫應(yīng)答，從而避免過強(qiáng)的免疫應(yīng)答對(duì)宿主腦組織產(chǎn)生損傷。

綜上，前炎癥和抗炎癥免疫應(yīng)答之間的平衡對(duì)于ECM的結(jié)局至關(guān)重要。本研究表明，日本血吸蟲感染會(huì)通過抑制DC亞群尤其是mDC的數(shù)量及 TLR9的表達(dá)水平來抑制DC的活化，以及巨噬細(xì)胞的數(shù)量和前炎癥介質(zhì)如NO和TNF-α等前炎癥免疫應(yīng)答，以及降低Th1細(xì)胞因子IFN-γ的水平，但對(duì)Treg的細(xì)胞數(shù)量未見有顯著影響，猜測(cè)是通過血吸蟲感染引起的Th2免疫應(yīng)答來抑制前炎癥免疫應(yīng)答，進(jìn)而緩解ECM的發(fā)生，從而延長(zhǎng)宿主生存期，也為瘧疾流行區(qū)的瘧疾防控提供了參考。