一種基于瓊脂糖凝膠電泳法檢測SARS-CoV-2的新方法

劉軍花， 李學龍， 劉茜陽， 于 琳， 吳珊珊， 尹秀山, ,3,4,5*

(1．沈陽化工大學 制藥與生物工程學院，遼寧 沈陽 110142；2．拜澳泰克(沈陽)生物醫(yī)學集團有限公司，遼寧 沈陽 110142；3．江蘇譜錄瑞醫(yī)療科技有限責任公司，江蘇 徐州 221000；4．海耐諾生物科技有限公司，上海 200000；5．拜澳泰克(江西)生物科技有限公司，江西 贛州 341000)

自2019年12月以來，在我國武漢地區(qū)突發(fā)的新型肺炎疫情的重要病原體是一種新型的人與其他靈長類共患性冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)[1-3]。經(jīng)相關(guān)測序鑒定，該冠狀病毒為一種含包膜結(jié)構(gòu)且呈單股正鏈的RNA病毒，與SARS[4](嚴重急性呼吸綜合征)和MERS[5](中東呼吸綜合征)的病毒同屬一個冠狀病毒亞科(Coronaviridae)[6-7]。隨后，世界衛(wèi)生組織(WHO)將此次新型肺炎事件命名為“COVID-19(Coronavirirus disease-2019)”，并且相應(yīng)的新型冠狀病毒被更名為SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)。Jasper等通過進化分析發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2基因組與源于蝙蝠SARS-like-CoVZXC21和源于人SARS-CoV的核苷酸序列的同源性分別為89%和82%[8]。據(jù)臨床報道，該病毒感染者常表現(xiàn)為高熱、咳嗽、胸悶、乏力、肌肉酸痛和嘔吐腹瀉等不同癥狀[9]，主要通過飛沫、氣溶膠、密切接觸或糞口傳播[16]等方式傳播，傳染力極強，潛伏期較長(一般為7～14 d)[10]。在Liu 等[11]的報告中顯示，該病毒的感染增長指數(shù)(reproduction number，R0)遠高于SARS，2020年2月8日之前，在全國范圍內(nèi)該病毒已確診感染人數(shù)高達3.4萬。根據(jù)中國疾控中心疫情實時報告數(shù)據(jù)顯示，截至2020年2月25日感染人數(shù)達7.8萬。診斷病毒感染疾病的主要手段包括病毒分離鑒定、CT影像學和分子生物學檢測等。病毒分離鑒定方法操作復(fù)雜，耗時費力，不利于診斷和治療效率[12]。而臨床的胸部CT掃描結(jié)果難以直接判斷顯影結(jié)果是由SARS-CoV-2病原感染所導(dǎo)致的真實性[13]，甚至無癥狀攜帶者的CT顯示呈陰性等。目前，SARS-CoV病毒特異性核酸檢測被認為是其診斷的金標準[14]。通過SARS-CoV-2病毒核酸鑒定，再聯(lián)合CT掃描結(jié)果進而獲得真實可靠的確診情況。Corman等[15]研究表明，實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)可以用于檢測SARS-CoV-2，但缺乏臨床適用性測試，本研究旨在建立一種基于瓊脂糖凝膠電泳法檢測SARS-CoV-2的新方法，并逐一進行條件優(yōu)化過程，為臨床診斷提供一個更簡便、省時且準確的分子檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 臨床COVID-19陽性樣本/病毒核酸RNA，由中國疾控中心CDC提供。

1.1.2 試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript III Reverse Transcription First-Strand Synthesis System(貨號：18080051)購自thermo公司；DNATaq聚合酶 (貨號：KT201) 購自北京天根公司；核酸染料購自北京GenStar公司；瓊脂糖購自上海生工公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR擴增儀(BIORAD-C1000，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；多功能電泳儀(北京六一公司)；離心機(Eppendorf-5424R，德國Eppendorf公司)。1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考GenBank提供的來自武漢的COVID-19代表性病例的基因組序列WH-human_1 genome，與其同源的幾種冠狀病毒SARS、Bat SL-CoV ZC45 和Bat SL-CoV ZXC21的序列進行同源性比對，針對SARS-CoV-2核酸序列的特異性區(qū)域[1](如orf1ab和surface glycoprotein)而進行設(shè)計。實驗采用的PCR擴增引物為N519引物(322 bp)和Wuhan 引物(547 bp)，序列見表1。以上涉及的引物均送至上海生工公司進行合成。

表1 實驗所涉及的引物序列

1.2.2 樣品處理 利用thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒將經(jīng)過處理的COVID-19陽性患者RNA(通常-80 ℃保藏)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 cDNA最優(yōu)濃度稀釋比例

1.2.3 檢測時間的優(yōu)化反應(yīng)條件 試劑盒KT201反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL(樣品cDNA終濃度4 ng/μL)，2×TaqPCR Mastermix 10 μL，F(xiàn)/R引物(10 μmol/L)各0.5 μL，其他由無菌水補至20 μL，陰性對照模板均用無菌水代替，標為NC。將含有樣品的PCR管經(jīng)過渦旋混勻并微離心，移至PCR儀進行擴增。擴增體系設(shè)置如下：第一階段94 ℃ 3 min；第二階段94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)35次；繼續(xù)72 ℃保持5 min，恢復(fù)至4 ℃孵育。 將PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物加入適量核酸染料，經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳130 V, 15 min后，結(jié)果進行紫外成像分析。為了提高檢測效率，針對PCR擴增第二階段的時間縮短至10 s、5 s，以獲得最優(yōu)的檢測時間。

1.2.4 檢測濃度的優(yōu)化反應(yīng)條件 最佳濃度優(yōu)化實驗流程同1.2.3的操作一致，在確定最優(yōu)擴增時間的基礎(chǔ)上，通過稀釋cDNA模板濃度，確定最優(yōu)的模板濃度。初始cDNA為4 ng/每個反應(yīng)，稀釋比例見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)檢測時間

最優(yōu)檢測時間結(jié)果分析見圖1，根據(jù)凝膠成像結(jié)果，在20 μL 的cDNA擴增反應(yīng)體系中，當PCR第二階段反應(yīng)時間縮短至5 s時，圖像顯示的結(jié)果與最初設(shè)置的30 s所反映的情況基本一致，條帶清晰，未出現(xiàn)條帶缺失現(xiàn)象。因此，可以確定在特定的條件下，當擴增時間縮短，理論上僅改變的是擴增產(chǎn)量，但在不丟失條帶的前提下，最短時間可以縮短至5 s，整體擴增反應(yīng)時間將減少至20～30 min以內(nèi)。

圖1 檢測時間優(yōu)化后的結(jié)果圖Fig.1 The result image after testing time optimizationA圖為表面糖蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域ORF1a/b的特定引物擴增陽性結(jié)果，擴增后的片段大小分別為547 bp和322 bp;B圖為PCR第二階段擴增時間縮短至10 s、5 s的兩組結(jié)果，其中每組實驗的樣品順序為DNA Marker，陰性對照，針對表面糖蛋白基因引物的擴增陽性樣品以及針對ORF1a引物的擴增陽性樣品，且每個條件設(shè)置有3個生物重復(fù)(初始病毒cDNA劑量為4 ng)The figure A shows the positive results of amplification with ORF1a/b and surface glycoprotein gene primer, and the fragment size after amplification is 547 bp and 322 bp respectively. The figure B show that when the second phase of the PCR amplification time reduced to 10 s, 5 s, Marking two groups, the order of samples is marker, negative control, three positive reapeats with primers, containing three biological duplication(initial viral cDNA dosage is 4 ng)

2.2 最佳檢測濃度

通常情況下，采集患者樣本(上呼吸道中的鼻咽拭子或下呼吸道中的痰液、支氣管肺泡灌洗液)的COVID-19病毒載量，可以間接地反映COVID-19病毒感染的嚴重程度。當樣本源于輕度感染者或者正處于潛伏期間的患者，則從上呼吸道中的病毒核酸獲得率較低。通過條件優(yōu)化檢測樣品濃度，以獲得采用最少量核酸而獲知最有效最準確的信息。圖2為最佳核酸濃度凝膠成像圖，從圖2可以看出，當稀釋比大于1∶5 000時，會出現(xiàn)陽性樣本條帶丟失現(xiàn)象，由此確定最佳檢測核酸濃度為(1∶1 000)～(1∶5 000)之間(初始值為4 ng/μL)。

根據(jù)以上所建立的方法，對COVID-19重癥感染病人所提取的病毒核酸進行檢測，結(jié)果表明擴增條帶清晰，可以初步用于疑似病例中是否感染COVID-19病原的檢測。

圖2 最佳檢測核酸濃度范圍Fig.2 The result image of the optimal detection concentration range A=1/10, B=1/50, C=1/100, D=1/500, E=1/1 000, F=1/5 000, G=1/10 000, H=1/50 000, and I=1/100 000(初始病毒cDNA劑量為4 ng)A=1/10, B=1/50, C=1/100, D=1/500, E=1/1 000, F=1/5 000,G=1/10 000, H=1/50 000, and I=1/100 000(initial viral cDNA dosage is 4 ng)

3 討 論

目前，國內(nèi)的COVID-19發(fā)病率及傳染力極其強大。感染SARS-CoV-2病毒的人群，通常會出現(xiàn)與流感病毒引起的感冒相似的癥狀，尤以發(fā)熱為主，少數(shù)也出現(xiàn)無癥狀感染者，但仍然具有在人群間感染的風險。因此，尋找一種有效且快速檢出SARS-CoV-2的方法，對SARS-CoV-2病毒感染者進行早期篩查并實施隔離防控是十分關(guān)鍵的。本研究建立了一種低成本且高效鑒定COVID-19的新方法——電泳法。該方法操作簡便、特異性強，適合病毒載量較小的樣本，可以直觀反映COVID-19病原在體內(nèi)的入侵情況，為SARS-CoV-2感染患者進行早期防控、臨床用藥及預(yù)后診斷提供分子技術(shù)參考。

說明本文第一作者受所有作者委托，對此前提交論文“一種基于瓊脂糖凝膠電泳法檢測SARS-CoV-2的新方法”的有關(guān)內(nèi)容做了印刷前的修改，特此說明。