康寧木霉對(duì)龜裂鏈霉菌MY02誘導(dǎo)活性及其誘導(dǎo)組分的初步分析

魏溪垚， 劉 秋， 于基成

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

提高放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量或獲得新型抗生素是抗生素研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通常提高放線菌抗生素產(chǎn)量的技術(shù)包括誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因重組等。近年來(lái)，利用微生物間的協(xié)同作用提高微生物活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也日益受到關(guān)注。徐淑蓓等[1]報(bào)道紅曲霉、紅茶菌及其與鹿角靈芝菌復(fù)合發(fā)酵后對(duì)靈芝菌胞外多糖產(chǎn)量均有明顯影響，紅曲霉與鹿角靈芝菌復(fù)合發(fā)酵后,靈芝菌胞外多糖產(chǎn)量增加15%;不同紅茶菌分離菌株對(duì)促進(jìn)鹿角靈芝胞外多糖的產(chǎn)生影響有所不同。張凡凡[2]通過(guò)將纖維素分解菌與不同發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌作為復(fù)合菌劑發(fā)酵青貯玉米，以期利用微生物間的協(xié)同作用提質(zhì)降耗。鄒曉等[3]利用白黑粉菌(Ustilagoesculenta)與紫紅曲霉(Monascusperpureuss)共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)到第8天洛伐他汀產(chǎn)量提高了203%。但目前的誘導(dǎo)作用多是關(guān)于利用真菌誘導(dǎo)處理植物細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行混合培養(yǎng)，促進(jìn)植物細(xì)胞大量合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的報(bào)道。許建峰等[4]利用6種真菌誘導(dǎo)物對(duì)高山紅景天細(xì)胞生長(zhǎng)與紅景天甙積累的影響，其中以黑曲霉誘導(dǎo)物效果最好。在細(xì)胞培養(yǎng)初期添加質(zhì)量濃度為10 mg/L的黑曲霉誘導(dǎo)物能使培養(yǎng)細(xì)胞中紅景天甙含量提高0.995%。前體與誘導(dǎo)物調(diào)控組合的運(yùn)用，最終使紅景天甙產(chǎn)量達(dá)到167.4 mg/L,是對(duì)照培養(yǎng)的3.5倍。而利用真菌誘導(dǎo)微生物積累次生代謝方面的研究卻相對(duì)較少。隨著細(xì)菌和真菌基因組研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)某些小分子的刺激可激活胞內(nèi)一些沉默途徑，尤其是一些次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的基因簇，從而獲得比傳統(tǒng)發(fā)酵更多的代謝產(chǎn)物[5]。因此，近年來(lái)有研究者在利用真菌誘導(dǎo)微生物生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物方面進(jìn)行了大膽嘗試，并在類(lèi)胡蘿卜素、海洋生物堿、靈芝多糖和靈芝酸、Monacolin K 和DMA 等方面取得了許多可喜成果[6-7]。本研究以真菌作為誘導(dǎo)菌株，評(píng)價(jià)其對(duì)放線菌龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)MY02活性的影響，并對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 龜裂鏈霉菌(S.rimosus)MY02、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf sp.cucumarinum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、香菇真菌(Lentinusedodes)均來(lái)自大連民族學(xué)院功能微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①菌株MY02發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g, 蛋白胨20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g, KH2PO42 g ，蒸餾水1 000 mL，pH自然；②PD培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；③PDA培養(yǎng)基：在PD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加18 g瓊脂制備成固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋(5Y0264，日本三洋電子有限公司)，天美多功能冷凍離心機(jī)(CT15RT，北京格瑞恩科技發(fā)展公司)，全溫培養(yǎng)搖床(211B，上海智城分析儀器制造有限公司)，超凈工作臺(tái)(ZHJH-C1112C，上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 真菌對(duì)菌株MY02活性的誘導(dǎo)作用 分別以康寧木霉和香菇真菌作為誘導(dǎo)菌株，以放線菌龜裂鏈霉菌MY02作為被誘導(dǎo)菌株，采用間隔對(duì)峙培養(yǎng)方法，即制備PDA平板培養(yǎng)基，將PDA平板分為5個(gè)平行區(qū)域，分別將菌株MY02與康寧木霉間隔對(duì)峙培養(yǎng)，最中間區(qū)域密集涂布誘導(dǎo)菌，然后依次密集涂布菌株MY02和誘導(dǎo)菌(圖1)。涂布完成后于28 ℃培養(yǎng)7 d。以黃瓜枯萎病菌作為指示菌，評(píng)價(jià)經(jīng)誘導(dǎo)后菌株MY02的活性變化。對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)束后，用打孔器取經(jīng)過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)后的菌株MY02菌塊。將菌塊分別置于含有指示菌的PDA固體平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，以未經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng)的菌株MY02菌塊作為對(duì)照，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，評(píng)價(jià)誘導(dǎo)菌株對(duì)菌株MY02活性的誘導(dǎo)作用。

1.2.2 康寧木霉誘導(dǎo)液的制備 將康寧木霉真菌(孢子濃度106個(gè)/mL)接種于PD培養(yǎng)液中，25 ℃，140 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液于10 000 r/min 離心20 min，上清液即為康寧木霉誘導(dǎo)液，將制備的康寧木霉誘導(dǎo)液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 菌株MY02與誘導(dǎo)菌間隔培養(yǎng)Fig.1 Isolated culture of actinomycetes and inducible bacteria

1.2.3 康寧木霉誘導(dǎo)液接種量對(duì)菌株MY02活性的影響 菌株MY02發(fā)酵至36 h，分別接入裝液量的0.2%、2%、20%上述制備的康寧木霉誘導(dǎo)液，28 ℃，140 r/min繼續(xù)發(fā)酵5 d。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定菌株MY02的發(fā)酵液活性，以未添加誘導(dǎo)液的菌株MY02發(fā)酵液活性為對(duì)照，比較康寧木霉誘導(dǎo)液對(duì)菌株MY02活性的影響。

1.2.4 康寧木霉添加時(shí)間對(duì)菌株MY02活性的影響 在菌株MY02發(fā)酵的不同階段(0、12、24、36、48 和60 h)，分別按照2%的量添加培養(yǎng)6 d 的康寧木霉誘導(dǎo)液，以確定誘導(dǎo)液的最佳添加時(shí)間。

1.2.5 康寧木霉誘導(dǎo)菌株的誘導(dǎo)組分初步分離 取100 mL發(fā)酵6 d的康寧木霉誘導(dǎo)菌株的發(fā)酵物，采用以下方式分別得到誘導(dǎo)菌株的4種組分。用6層無(wú)菌紗布將菌絲體與發(fā)酵液分開(kāi)，將過(guò)濾獲得的菌絲體用無(wú)菌水洗滌3次，洗去表面培養(yǎng)基，8 000 r/min離心20 min，棄上清。將菌絲體沉淀置于50 mL離心管中，超聲破碎后，12 000 r/min離心10 min，將上清液與沉淀分開(kāi)，沉淀標(biāo)記為組分Ⅰ；菌絲沉淀離心得到的上清為細(xì)胞破碎釋放的內(nèi)含物，標(biāo)記為組分Ⅱ；紗布過(guò)濾后得到的發(fā)酵液再用0.22 μm濾膜除菌，標(biāo)記為組分Ⅲ；組分Ⅲ經(jīng)高溫高壓處理后標(biāo)記為組分Ⅳ。

1.2.6 康寧木霉誘導(dǎo)菌株的誘導(dǎo)組分分析 將康寧木霉誘導(dǎo)菌株的發(fā)酵液真空濃縮，乙醇沉淀，8 000 r/min離心20 min，將沉淀與上清液分開(kāi)，乙醇沉淀物于65 ℃烘干后，再用100 mL雙蒸水復(fù)溶，標(biāo)記為組分Ⅴ，主要成分為蛋白質(zhì)及多糖；上清液真空濃縮除去乙醇，同樣用100 mL雙蒸水溶解，標(biāo)記為組分Ⅵ，命名為FECS。組分Ⅴ采用Sevag試劑除蛋白4次，然后用透析袋除鹽，得到的組分命名為EPS。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同真菌對(duì)菌株MY02活性的誘導(dǎo)作用

當(dāng)菌株MY02分別與香菇真菌和康寧木霉共培養(yǎng)時(shí)，均能顯著提高菌株MY02的活性，其抑菌圈直徑分別從對(duì)照(無(wú)誘導(dǎo)菌株)的18.2 mm增至27.0 mm和34.6 mm，可見(jiàn)兩種真菌均對(duì)菌株MY02具有明顯的活性誘導(dǎo)作用(圖2)。其中康寧木霉對(duì)菌株MY02具有更高的誘導(dǎo)活性，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了康寧木霉不同組分對(duì)菌株MY02的誘導(dǎo)效果。

2.2 康寧木霉誘導(dǎo)液接種量對(duì)菌株MY02活性的影響

當(dāng)接種量為2%時(shí)，共培養(yǎng)的混合發(fā)酵液中菌株MY02的活性最高，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為(31.3±0.1) mm。因此，2%為最佳誘導(dǎo)菌株接種量(圖3)。

圖2 不同真菌對(duì)菌株MY02活性的誘導(dǎo)作用Fig.2 Induction of MY02 activity by different Fungia：菌株MY02單獨(dú)培養(yǎng)的抑菌活性；b：菌株MY02與香菇真菌共培養(yǎng)后的抑菌活性；c：菌株MY02與康寧木霉共培養(yǎng)后的抑菌活性a： Antifungal activity of S. rimosus MY02 cultured alone; b： Antifungal activity of S. rimosus MY02 co-cultured with Lentinus edodes; c： Antifungal activity of S. rimosus MY02 co-cultured with T. koningii

圖3 誘導(dǎo)菌株接種量對(duì)菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.3 Effect of induced strain inoculation quantity on antifungal activity of strain MY02

2.3 康寧木霉誘導(dǎo)菌的發(fā)酵液添加時(shí)間對(duì)菌株MY02活性的影響

由圖4可知，誘導(dǎo)菌株發(fā)酵液接種時(shí)間在0～36 h時(shí)，隨著誘導(dǎo)菌株發(fā)酵液接種時(shí)間的增長(zhǎng)，抑菌圈直徑隨之增大，菌株MY02的活性也隨之增強(qiáng)。當(dāng)誘導(dǎo)菌株接種時(shí)間為菌株MY02發(fā)酵36 h時(shí)，發(fā)酵液活性最大，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為(31.3±0.1) mm。36 h后，隨誘導(dǎo)菌株接種時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑減小。因此，選擇誘導(dǎo)菌株發(fā)酵液在菌株MY02發(fā)酵36 h時(shí)為最佳添加時(shí)間。

2.4 誘導(dǎo)菌株誘導(dǎo)組分的初步分析

按照1.2.5處理后分別得到4種康寧木霉誘導(dǎo)組分，由圖5可知，4種誘導(dǎo)組分的誘導(dǎo)效果不盡相同。其中菌株MY02在分別添加誘導(dǎo)組分菌絲沉淀物(組分Ⅰ)和菌絲裂解液(組分Ⅱ)發(fā)酵后，菌株MY02抗真菌活性沒(méi)有增加，說(shuō)明康寧木霉菌絲及其裂解液沒(méi)有誘導(dǎo)活性。處理方式Ⅲ和處理方式Ⅳ，即除掉菌絲的發(fā)酵液以及經(jīng)過(guò)高溫高壓處理的除掉菌絲的發(fā)酵液添加到MY02培養(yǎng)基中，菌株MY02的抗真菌活性較對(duì)照組均有所提高。其中組分Ⅲ對(duì)MY02 抗真菌活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)(抑菌圈直徑為(31.3±0.9) mm，說(shuō)明康寧木霉對(duì)菌株MY02抗真菌活性的誘導(dǎo)組分在發(fā)酵液中,且誘導(dǎo)組分抗高溫。

圖4 誘導(dǎo)菌株接種時(shí)間對(duì)菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.4 Effect of induced strain inoculation time on antifungal activity of strain MY02

圖5 誘導(dǎo)菌株發(fā)酵液不同組分對(duì)菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.5 Effect of different components of induced fermentation broth on antifungal activity of strain MY02

由圖6可知，在菌株MY02發(fā)酵36 h時(shí)，添加等濃度等體積的FECS和EPS對(duì)MY02抗真菌活性都有促進(jìn)作用。FECS為菌株MY02發(fā)酵液的乙醇沉淀物，其組分包括蛋白和多糖大分子物質(zhì)，EPS則是通過(guò)Sevag法去除蛋白，其主要組分為多糖類(lèi)物質(zhì)，由此可見(jiàn)，康寧木霉發(fā)酵產(chǎn)生的多糖類(lèi)物質(zhì)為主要誘導(dǎo)組分，能夠明顯誘導(dǎo)增強(qiáng)菌株MY02的抗真菌活性。

圖6 誘導(dǎo)菌株發(fā)酵液不同組分對(duì)菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.6 Effect of different components of induced strain fermentation broth on antifungal activity of strain MY02

3 討 論

目前，關(guān)于真菌誘導(dǎo)子作用機(jī)制的研究多集中于對(duì)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)活性上，利用真菌誘導(dǎo)微生物積累次生代謝方面的研究卻相對(duì)較少，對(duì)真菌誘導(dǎo)子與微生物細(xì)胞間相互作用的研究也相對(duì)滯后。但是近年來(lái)很多人對(duì)其進(jìn)行了研究。梁楚欣等[8]報(bào)道，真菌誘導(dǎo)子以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì), 成為提高長(zhǎng)春花中萜類(lèi)吲哚生物堿含量的其中一種重要手段。而王紅[9]報(bào)道，采用3種真菌誘導(dǎo)子，即大麗花輪枝孢(Verticilliumdahliae)、葡枝根霉(Rhiczopusstolonifer)和束狀刺盤(pán)孢(Colletotrichumdematium)分別處理青蒿，3種真菌誘導(dǎo)子對(duì)青蒿發(fā)根生長(zhǎng)和青蒿素生物合成有明顯正向誘導(dǎo)的影響。黃曲霉真菌誘導(dǎo)子[10]對(duì)長(zhǎng)春花形成層分生組織細(xì)胞內(nèi)萜類(lèi)吲哚生物堿產(chǎn)生的影響。王亞洲等[11]報(bào)道，產(chǎn)黃青霉真菌和黑曲霉真菌制備的類(lèi)似于丁醇的誘導(dǎo)子能有效促進(jìn)納他霉素的合成。Wang[12]研究了真菌誘導(dǎo)劑對(duì)納他鏈霉菌HW-2理化及微生物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)子能使干細(xì)胞重量(DCW)降低17.7%，提高了葡萄糖的利用率。李文淵等[13]報(bào)道了生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參有效成分次生代謝具有誘導(dǎo)和調(diào)控作用。

Charusanti等[14]提出和病原菌的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)誘導(dǎo)鏈霉菌發(fā)生適應(yīng)進(jìn)化，從而產(chǎn)生新的抗生素來(lái)抑制病原菌的假說(shuō)，利用基于競(jìng)爭(zhēng)的自適應(yīng)進(jìn)化策略篩選產(chǎn)生新化合物或提高己有化合物產(chǎn)量的突變株。

目前，人們對(duì)康寧木霉的研究多集中在其高產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶等機(jī)制及應(yīng)用研究上[15]，而對(duì)其誘導(dǎo)鏈霉菌活性提高的研究則鮮有報(bào)道。本研究評(píng)價(jià)了康寧木霉對(duì)龜裂鏈霉菌MY02的誘導(dǎo)活性及其誘導(dǎo)組分的初步分析。其結(jié)果顯示，當(dāng)以康寧木霉和香菇真菌作為誘導(dǎo)菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)MY02的抗真菌活性均具有明顯的正向誘導(dǎo)作用。當(dāng)以康寧木霉作為誘導(dǎo)菌時(shí)，其最佳誘導(dǎo)條件為接種量為2%，發(fā)酵36 h時(shí)為最佳添加時(shí)間。同時(shí)，通過(guò)初步分析可知，康寧木霉的誘導(dǎo)組分為發(fā)酵產(chǎn)生的多糖類(lèi)物質(zhì)。