糖胺聚糖降解菌株的篩選及鑒定

雷 曦， 周峻沛,2,3,4， 黃遵錫,2,3,4， 丁 琳， 張 蕊,2,3,4*

(1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500;2.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程中心，云南 昆明 650500；3.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650500；4.云南師范大學(xué) 酶工程重點實驗室，云南 昆明 650500)

糖胺聚糖(Glycosaminoglycans, GAG)，由己糖、己糖醛酸或己糖胺組成的重復(fù)二糖單元構(gòu)成，是一類作為細胞骨架成分的大分子酸性直鏈多糖[1]。糖胺聚糖位于細胞表面和基質(zhì)，常與蛋白質(zhì)相互作用參與生物體內(nèi)一系列重要的生理功能，如細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和識別等過程。但糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多樣，通常根據(jù)二糖單位的不同，可將糖胺聚糖分為透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素和硫酸乙酰肝素[2]。糖胺聚糖降解酶(Glycosaminoglycan degrading enzyme)是一類能夠?qū)⒋蠓肿犹前肪厶墙到獬晒烟羌安伙柡投堑奈镔|(zhì)，主要來源于動物和微生物[3-5]。在醫(yī)療方面，臨床常作為滲透劑，降解細胞基質(zhì)間的透明質(zhì)酸，提高組織通透性，從而加快注射藥物的擴散和吸收[6]，糖胺聚糖降解酶也可用于治療心肌梗死、腫瘤、牙周炎以及一些眼科疾病[7-9]。在食品方面，該酶的降解產(chǎn)物糖胺寡糖可作為食品或保健品，具有促進血管生成和創(chuàng)傷愈合的作用[10-11]。在工業(yè)生產(chǎn)方面，糖胺聚糖降解酶可替代傳統(tǒng)石灰浸灰松散動物皮革，改進制革工藝，降低制革過程對環(huán)境的污染[12]。目前，可利用的糖胺聚糖降解酶的數(shù)量有限，市售的糖胺聚糖降解酶價格昂貴，遠遠不能滿足醫(yī)療、食品和其他工業(yè)的需求。糖胺聚糖降解酶根據(jù)降解底物特異性分為透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase)、硫酸軟骨素酶(Chondroitinase)和肝素酶(Heparinase)等。多數(shù)微生物來源糖胺聚糖降解酶可同時降解透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素[6]。微生物來源酶具有產(chǎn)量高、活力強、性質(zhì)多樣、易于異源重組表達等特點，是工業(yè)酶制劑的主要研究對象。而土壤細菌作為最重要的土壤生態(tài)系統(tǒng)部分，數(shù)量龐大且種類豐富，在分解有機物、礦物質(zhì)以及生產(chǎn)各種各樣功能酶和其他產(chǎn)物等方面發(fā)揮著重要作用[13]。因此，從生物多樣性較高的土壤中篩選具有糖胺聚糖降解酶活性的菌株有著重要的理論和應(yīng)用的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤采集 選擇有機物質(zhì)豐富且盡量是有動物棲息的地區(qū)作為土壤樣品采集地點，取土壤表層以下2～8 cm的土樣約200 g，置冰運輸。材料來源于云南省西雙版納、玉溪、普洱、紅河、麗江、昆明等地的土壤和淤泥。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO410，NaCl 5，硫酸軟骨素(CS) 2，透明質(zhì)酸(HA) 2；②篩選培養(yǎng)基：腦心浸液肉湯(BHI) 38.5，瓊脂 20，硫酸軟骨素 2，透明質(zhì)酸 2；③純化培養(yǎng)基：腦心浸液肉湯(BHI) 38.5，瓊脂 20。

1.1.3 試劑 BSA-乙酸溶液：100 g/L牛血清白蛋白Ⅴ組份與乙酸4∶1混合；氯化鈉；硫酸軟骨素；透明質(zhì)酸鈉；檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液：0.2 mol/L檸檬酸+0.2 mol/L磷酸氫二鈉；DNS終止液；細胞裂解液；瓊脂糖；TBE電泳緩沖液。

1.1.4 儀器與設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱(DHP9052，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；震蕩培養(yǎng)箱(ZQWY-200N，上海知楚儀器有限公司)；系列酶標分析儀(HBS-1096，南京德鐵實驗設(shè)備有限公司)；水浴鍋(DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；PCR儀(ETC-811，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)；便攜式pH計(梅特勒-托利多儀器公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；核酸電泳儀(美國Bio-Rad公司)；超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 方法

1.2.1 土壤細菌的篩選 ①富集培養(yǎng)和分離：每份土壤稱量約30 g倒入錐形瓶中，再加入100 mL無菌生理鹽水溶液，充分搖晃使土壤散開后靜置浸提1 h[14]。取1 mL土壤浸提液加入100 mL富集培養(yǎng)基中，160 r/min，37 ℃通風(fēng)培養(yǎng)至富集培養(yǎng)基變渾濁(約60 h)。培養(yǎng)富集菌：在篩選培養(yǎng)基上劃線分離，平板于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)直至出現(xiàn)明顯單菌落，挑選形態(tài)不一的菌落并進一步在純化培養(yǎng)基上劃線分離。②糖胺聚糖降解菌株的初篩：BSA在酸性條件下可與GAG結(jié)合形成絡(luò)合物沉淀，而使含GAG的固體培養(yǎng)基發(fā)生濁度反應(yīng)，但是GAG若被菌落降解則無反應(yīng)，因而有活性的菌落周圍會產(chǎn)生透明圈，即為陽性反應(yīng)，反之無透明圈則為陰性反應(yīng)[15]。將平板上待篩選菌株編號并轉(zhuǎn)接于650 μL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)6 h。加入3 mL BSA-乙酸混合液至平板中，左右傾斜至鋪滿平板，反應(yīng)5～10 min，將BSA溶液倒掉，觀察預(yù)先標記挑菌位置有無透明圈，記錄產(chǎn)透明圈菌株。③糖胺聚糖降解菌株的復(fù)篩：初篩呈陽性的菌株接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，160 r/min，37 ℃培養(yǎng)6 h后取2 mL轉(zhuǎn)入200 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃通風(fēng)培養(yǎng)約15 h(培養(yǎng)至細菌發(fā)酵液在600 nm測量的OD值為0.65～0.75)。將發(fā)酵液在6 000 r/min，離心8 min，棄上清，沉淀用檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH 7.0)緩沖液重懸，超聲破碎后12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清得到粗酶。并用DNS法[16]檢測酶活性，取450 μL底物(5 g/L透明質(zhì)酸或5 g/L硫酸軟骨素)加至試管中放入37 ℃水浴鍋預(yù)熱5 min，加入60 μL粗酶反應(yīng)1 h后，加750 μL DNS終止液終止反應(yīng)，空白組中先加入750 μL DNS終止液后再加60 μL酶液。最后將試管放入沸水浴中煮沸，透明質(zhì)酸為底物時煮沸5 min，硫酸軟骨素為底物時煮沸4 min。冷卻后，測定540 nm的OD值，以市售的(索萊寶公司)糖胺聚糖酶(1 mg/mL)吸光值作為100%對照，計算粗酶的相對酶活。

1.2.2 糖胺聚糖降解菌株的16S rDNA鑒定 ①模板DNA提取[17]：復(fù)篩的菌株進行平板劃線培養(yǎng)再分純，接種針蘸取LB培養(yǎng)基中保存的菌液，平板劃線放入37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 h。用無菌牙簽挑取平板劃線分純的單菌落，攪拌懸于30 μL細胞裂解液中，放入80 ℃金屬浴15 min，裂解出細菌的總DNA后取出置冰箱備用。②PCR擴增16S rDNA：以提取的總DNA為模板，用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR擴增菌株的16S rDNA序列[18]。40 μL PCR反應(yīng)體系中含有rTaq酶0.6 μL，模板DNA 2 μL，引物27F和1492R(20 μmol/L)各1 μL，10×Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，ddH2O 29.4 μL。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，送陽性樣品至擎科生物公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAman拼接后，在NCBI上進行BlastN比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。③16S rDNA系統(tǒng)進化樹構(gòu)建：用所有活性菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[19]。測序結(jié)果在Clustal X軟件上進行多序列比對，根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計算核苷酸的距離矩陣，再用MEGA 4.0軟件的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap值為1 000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

從83份土壤樣品中共分離了418個菌株，初篩116株菌株出現(xiàn)透明圈呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，復(fù)篩13株菌株具有糖胺聚糖降解酶活力。糖胺聚糖降解菌株篩選結(jié)果見表1，7株來自西雙版納的土壤樣品，2株來自普洱的土壤樣品，1株來自玉溪的土壤樣品，3株來自昆明的土壤樣品。

用透明質(zhì)酸(HA)和硫酸軟骨素(CS)為底物，以索萊寶公司的糖胺聚糖酶(1 mg/mL)作標準對照(CK)，獲得13株糖胺聚糖降解能力的菌株(圖1)。篩選到13株菌株均具有降解透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素能力。其中，多數(shù)菌株透明質(zhì)酸酶活力高于硫酸軟骨素的酶活力，菌株BN3-1的透明質(zhì)酸酶的活性明顯高于其他菌株。

表1 糖胺聚糖降解菌株篩選結(jié)果

圖1 不同菌株的相對酶活Fig.1 Enzymatic activities of strains

2.2 16S rDNA鑒定結(jié)果

13株菌16S rDNA的PCR電泳結(jié)果顯示單一明顯條帶，大小在1 500 bp左右。測序拼接后，將13株菌株16S rDNA序列分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中的核酸序列比對，BlastN比對結(jié)果匯總于表2。結(jié)果顯示，與比對菌種同源性最高的菌株可能來自不同的科或不同的屬，如B11-1與棲木假單胞菌(假單胞菌科假單胞菌屬)和嗜麥芽窄食單胞菌(黃單胞菌科窄食單胞菌屬)均具有99.86%最高一致性。因此，需要結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類分析，進一步對13株菌株鑒定分析。

分析同源性高的菌種中糖胺聚糖降解酶研究情況(表2)，蠟樣芽胞桿菌(KM6-6最高一致性99.86%)和枯草芽胞桿菌(KM8-2最高一致性98.89%)來源的糖胺聚糖降解酶已有功能驗證的研究；弗氏檸檬酸桿菌(BN3-1最高一致性98.86%)和沙門氏菌(BN3-1最高一致性98.74%)中發(fā)現(xiàn)了糖胺聚糖降解酶基因但未研究過其功能；而在蔗糖小迫氏菌、陰溝腸桿菌和成團泛菌等8株菌中還未發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖降解酶基因以及酶功能研究的報導(dǎo)。

對13株菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖2)。BN11-1與KM1-1(假單胞菌科假單胞菌屬)位于同一進化分支上，親緣關(guān)系近。因此，結(jié)合比對結(jié)果和系統(tǒng)進化樹分析，BN11-1菌株應(yīng)屬于假單胞菌科假單胞菌屬。有9株為腸桿菌科，BN1-3、BN18-1、BN20-2、BN24-5、PE2-1、BN3-3、YX11-5分別是腸桿菌屬、Kosakonia屬或拉烏爾菌屬等，位于同一個進化分支，彼此親緣關(guān)系近。BN3-1和PE5-2屬于腸桿菌科的枸櫞酸桿菌屬、沙門氏菌屬或西地西菌屬等，位于另外一個進化分支，與上述7個菌種進化關(guān)系較遠。

表2 活性菌株16S rDNA比對結(jié)果

圖2 16S rDNA系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree constructed on the basis of 16S rDNA sequences

3 討 論

目前市售糖胺聚糖降解酶大都是從動物睪丸或卵巢中提取[22]，由于成本高，提取困難，導(dǎo)致價格昂貴。所以，現(xiàn)在研究的重點方向是微生物來源的糖胺聚糖酶，大部分研究的糖胺聚糖降解酶都來源于鏈球菌，酶活大約在幾千至上萬個單位每毫克[21]。因此，篩選產(chǎn)高活性糖胺聚糖降解酶的細菌很有必要。

本研究根據(jù)微生物產(chǎn)酶分解糖胺聚糖的特點，從80份土壤樣品中篩選出13株具有糖胺聚糖降解活性的菌株，最后對其進行了16S rDNA測序鑒定，在一定程度上豐富了功能微生物資源的開發(fā)。據(jù)文獻報道，產(chǎn)糖胺聚糖酶裂解酶的細菌主要有梭菌屬、微球菌、鏈球菌、鏈霉菌等[5]。本研究篩菌結(jié)果包括了腸桿菌科、黃單胞菌科、假單胞菌科、芽胞桿菌科，來源于芽胞桿菌和黃單胞菌的糖胺聚糖降解酶有過報道。例如，薛蔚[14]報道的Bacillussp.TF18能降解大分子的透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素，優(yōu)化發(fā)酵條件后酶產(chǎn)量是15 U/mL，郭學(xué)平[21]從芽胞桿菌Bacillussp.A50純化糖胺聚糖酶，對透明質(zhì)酸的裂解活性活性高達109 U/mL。MacDonald等[20]從一株嗜麥芽窄食單胞菌中獲得了一種多糖裂解酶，通過大腸埃希菌異源表達在最適反應(yīng)條件下測定對透明質(zhì)酸的裂解活性有42.3 U/mg。但是腸桿菌科、假單胞菌科來源的糖胺聚糖降解酶鮮有研究，部分菌屬如枸櫞酸桿菌屬、假單胞菌屬在NCBI數(shù)據(jù)庫中能找到糖胺聚糖降解酶的相關(guān)基因，有潛在的蛋白序列，但是均未進行酶的功能研究。其他產(chǎn)酶菌可能是由于物種不完全相同或未進行過基因組相關(guān)功能的分析，因此所篩出的13個菌株可能有10株菌能產(chǎn)新型的糖胺聚糖降解酶。

本研究在酶活性檢測中，BN3-1顯示出較高的酶活性，初步鑒定為枸櫞酸桿菌屬菌株，NCBI數(shù)據(jù)庫中具有該物種的糖胺聚糖-裂解酶相似基因，但未見相關(guān)酶研究報道。后續(xù)將對其及其他可能產(chǎn)新型的糖胺聚糖降解酶菌株進行克隆，再將新型的糖胺聚糖降解酶基因進行異源表達，大批發(fā)酵純化糖胺聚糖降解酶并研究其功能和應(yīng)用。