非生物脅迫因子對(duì)棘孢木霉嗜鐵素及鈣調(diào)磷酸酶基因表達(dá)的影響

王 越， 趙 蕾

(山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類種類繁多、功能多樣的絲狀真菌，是當(dāng)前綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最具應(yīng)用潛力的生防微生物之一，能增強(qiáng)植物抗生物和非生物脅迫的能力[1-2]。隨著對(duì)木霉菌生防機(jī)制的深入研究，木霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝物在生防、促生及誘導(dǎo)植物抗病中的作用日益受到重視，迄今為止，已經(jīng)明確結(jié)構(gòu)的木霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物有100多種，其中對(duì)嗜鐵素(siderophore)的研究近年來(lái)受到關(guān)注。嗜鐵素又稱鐵載體，是微生物在缺鐵環(huán)境中分泌的一種能夠特異性螯合兼轉(zhuǎn)運(yùn)三價(jià)鐵離子到微生物或植物體細(xì)胞內(nèi)的小分子水溶性化合物。真菌嗜鐵素屬于異羥肟酸型，均含有N5-acyl-N5-hydroxyornithine結(jié)構(gòu)單元[3]，對(duì)真菌自身的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用[1,4]。進(jìn)化樹分析表明，木霉屬中SidA基因 和NPS6 基因參與嗜鐵素的合成，并起關(guān)鍵作用[3]。盡管目前對(duì)某些真菌(如曲霉菌)嗜鐵素的結(jié)構(gòu)、類型有了較為清楚的了解，但逆境對(duì)木霉菌產(chǎn)生嗜鐵素的影響及調(diào)控機(jī)制尚不明確，有待于在理論上進(jìn)一步完善與補(bǔ)充。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離鑒定的高產(chǎn)嗜鐵素棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株T6是本實(shí)驗(yàn)的重要材料。鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由一個(gè)催化亞基(CnA) 和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(CnB) 組成，在真核生物中廣泛存在[5-8]。其酶活功能主要由A亞基體現(xiàn)，B亞基主要起調(diào)節(jié)作用[9]。鈣調(diào)磷酸酶與多種真菌抗逆性有關(guān)，在隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、白色念珠菌(Candidatropicalis)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)等真菌中，具有調(diào)控菌體生長(zhǎng)、細(xì)胞壁完整性、致病性[10-12]以及對(duì)外源離子脅迫反應(yīng)[13]等重要作用。目前，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，絲狀真菌中鈣調(diào)磷酸酶的功能也越來(lái)越多的受到人們的關(guān)注，但鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路對(duì)木霉次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控和機(jī)制并不明確，對(duì)鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路與嗜鐵素合成關(guān)系的研究也未見(jiàn)報(bào)道。缺鐵脅迫能誘導(dǎo)木霉產(chǎn)大量的嗜鐵素，本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)木霉菌及其嗜鐵素能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[14]，但其他脅迫因素對(duì)木霉嗜鐵素合成的影響尚不明確，與菌體抗脅迫能力相關(guān)的鈣調(diào)磷酸酶基因與嗜鐵素基因之間的調(diào)控關(guān)系也不清楚，因此，本研究選擇常見(jiàn)的土壤環(huán)境脅迫因子NaCl、pH以及參與調(diào)節(jié)鈣調(diào)磷酸酶途徑的Ca2+作為影響因子，分別研究其對(duì)棘孢木霉菌T6的嗜鐵素產(chǎn)量以及對(duì)嗜鐵素合成關(guān)鍵基因(SidA)與鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因(CnA)表達(dá)的影響，從而初步明確木霉抗逆和嗜鐵素合成的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大木霉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 棘孢木霉菌(Trichodermaasp-erellum)T6(由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，LNM(Liquid Nutrient Medium)培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 RNA提取試劑(大連TaKaRa生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；引物合成(上海生工生物工程有限公司)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；振蕩培養(yǎng)箱(SPX-250B-D型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；冷凍離心機(jī)(5410R型，德國(guó) Eppendorf 公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6型，國(guó)華電器有限公司)；T6新世紀(jì)-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；PCR儀(6331型，德國(guó) Eppendorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將棘孢木霉菌T6接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)至木霉菌絲體表面被綠色孢子覆蓋，向平板中倒入適量無(wú)菌水，無(wú)菌槍頭多次吹打混勻。吸取適量體積的高濃度孢子液加入含玻璃珠的錐形瓶中，搖勻打散孢子，置于顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)整為1×107cfu/mL，備用。

1.2.2 嗜鐵素產(chǎn)量的測(cè)定[15]取1 mL濃度為107cfu/mL孢子懸液，接種至LNM液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，11 000 r/min，離心15 min，取上清。按體積比1∶1加入CAS檢測(cè)液，充分混勻后于黑暗中室溫靜置30 min，630 nm處測(cè)吸光值(As)，以雙蒸水為對(duì)照調(diào)零。另取空白培養(yǎng)基與CAS檢測(cè)液等體積混勻，以其吸光值作參比值(Ar)，根據(jù)公式((Ar-As)/Ar) × 100 %，計(jì)算出嗜鐵素的相對(duì)含量。按上述方法分別測(cè)定在不同的NaCl濃度、CaCl2濃度及pH 值條件下的嗜鐵素產(chǎn)量，作圖比較。其中NaCl濃度分別為0、100、300、500、800、1 000 mmol/L，CaCl2濃度分別為0、0.5、1、3、5、10 mmol/L，pH值分別為2.9、4.9、6.9、8.9、10.9。所有處理均設(shè)3組重復(fù)。

1.2.3 環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A, CsA)對(duì)棘孢木霉菌T6嗜鐵素產(chǎn)量的影響 向LNM培養(yǎng)基中加入鈣調(diào)磷酸酶專性抑制劑CsA，使其終濃度為30 μmol/L，另設(shè)空白對(duì)照，分別接種1 mL濃度為107cfu/mL棘孢木霉菌T6孢子懸液，28 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d、11 000 r/min、離心15 min，取上清液，測(cè)定其嗜鐵素含量及菌體的生物量，計(jì)算單位菌體嗜鐵素含量。

1.2.4 脅迫對(duì)棘孢木霉菌T6嗜鐵素基因與鈣調(diào)磷酸酶基因表達(dá)的影響 取1 mL濃度為107cfu/mL的孢子懸液分別加到不同處理的LNM液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，收集菌絲，提取各樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA作為PCR模板。50 μL半定量PCR擴(kuò)增體系含: 2×TaqMaster Mix(諾唯贊，南京)，正反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板cDNA 100 ng。每個(gè)樣品3次重復(fù)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 脅迫因子對(duì)棘孢木霉菌T6嗜鐵素產(chǎn)量的影響

振蕩培養(yǎng)5 d后，測(cè)量嗜鐵素相對(duì)含量。與對(duì)照組(0 mol/L NaCl)相比，NaCl濃度為100、300、 500、800以及1 000 mmol/L時(shí)，其嗜鐵素產(chǎn)量分別下降了2.174%、8.597%、31.64%、81.92%以及100%(圖1A)，NaCl濃度為1 mol/L時(shí)，完全抑制了菌體T6的生長(zhǎng)。由圖1B可知，CaCl2濃度為0.5 mmol/L時(shí)，嗜鐵素含量略有增加，而隨著CaCl2濃度的增加，嗜鐵素相對(duì)含量降低，CaCl2濃度為10 mmol/L時(shí)，嗜鐵素的合成被完全抑制。另外，pH 4.9時(shí)，T6的胞外嗜鐵素產(chǎn)量最高，pH 6.9次之，pH 8.9最低，即pH的增加會(huì)抑制嗜鐵素的產(chǎn)生(圖1C)。

圖1 不同處理對(duì)棘孢木霉T6嗜鐵素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different treatment on siderophore production of T. asperellum T6圖中a、b、c、d、e、f代表顯著性差異a,b,c,d,e,f represents a significant difference in the figures

2.2 CsA對(duì)棘孢木霉菌T6嗜鐵素產(chǎn)量的影響

按1.2.2方法操作，取上清液，測(cè)定其嗜鐵素含量及菌體的生物量。結(jié)果見(jiàn)圖2，加入CsA后單位菌體嗜鐵素相對(duì)含量增加，說(shuō)明鈣調(diào)磷酸酶活性被抑制反而促進(jìn)了嗜鐵素的產(chǎn)生，推測(cè)鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路負(fù)調(diào)控木霉嗜鐵素的產(chǎn)生。

圖2 CsA對(duì)棘孢木霉T6嗜鐵素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of CsA on the siderophore production of T. asperellum T6

2.3 脅迫因子對(duì)棘孢木霉菌T6 SidA和CnA基因表達(dá)量的影響

由圖3可知，每種處理由上向下依次為鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因(CnA)、嗜鐵素合成關(guān)鍵基因(SidA)以及內(nèi)參基因(Act)。NaCl濃度的增加可以促進(jìn)CnA基因的表達(dá)，而SidA基因的表達(dá)下調(diào)，且顯著低于CnA基因表達(dá)量。CaCl2處理下，CnA基因表達(dá)量隨著CaCl2濃度的升高而增加，當(dāng)CaCl2濃度為10 mmol/L時(shí)，其表達(dá)量最高；SidA基因的表達(dá)量先增加后降低，且當(dāng)CaCl2濃度為10 mmol/L時(shí)，SidA基因的表達(dá)已被完全抑制，該結(jié)果與嗜鐵素含量測(cè)定結(jié)果相一致。不同pH條件下，SidA基因表達(dá)量均下降，pH 4.9時(shí)SidA基因表達(dá)量最高，該結(jié)果與嗜鐵素含量測(cè)定結(jié)果相一致。而pH 10.9時(shí)CnA基因表達(dá)量未提高，原因可能是過(guò)堿條件不適合菌體生長(zhǎng)。

圖3 不同處理對(duì)棘孢木霉T6 SidA基因與CnA基因的影響Fig.3 Effect of different treatment on SidA gene and CnA gene of T. asperellum T6

3 討 論

脅迫對(duì)木霉生長(zhǎng)的影響是多方面的，既包括生長(zhǎng)的變化，也包括各種生理生化等方面的變化。例如，隨著NaCl濃度增加，哈茨木霉(T.harzianum) SH2303的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和幾丁質(zhì)酶活性明顯下降[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，60 mmol/L的NaCl能夠提高棘孢木霉Q1的酸性磷酸酶與堿性磷酸酶產(chǎn)量[17]，但當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)，棘孢木霉Q1的嗜鐵素產(chǎn)量受到抑制[18]。本研究發(fā)現(xiàn)NaCl濃度為300～1 000 mmol/L時(shí)不僅降低了棘孢木霉菌T6的嗜鐵素產(chǎn)量，且NaCl濃度越高，嗜鐵素產(chǎn)量越低。另外，高濃度CaCl2(10 mmol/L) 和高pH (pH 8.9) 對(duì)菌株T6嗜鐵素產(chǎn)量也具有抑制作用，說(shuō)明脅迫因子能夠降低棘孢木霉菌T6的嗜鐵素產(chǎn)量。

鈣調(diào)磷酸酶基因參與真菌對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。高鹽條件下，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 胞內(nèi)鈣離子信號(hào)增強(qiáng)，鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)途徑被激活，鈣調(diào)磷酸酶基因表達(dá)上調(diào)[19]。李志勇等[20]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析了粟彎孢霉葉斑病菌(Curvularialunata) 中ClCna基因和ClCnb基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在高濃度NaCl和山梨醇誘導(dǎo)下，ClCnb與ClCna基因表達(dá)量均升高，說(shuō)明高鹽和高滲透脅迫可以調(diào)控粟彎孢霉葉斑病菌鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路。本研究對(duì)SidA基因與CnA基因表達(dá)進(jìn)行半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，在高濃度鈉鹽和高濃度鈣鹽脅迫下，棘孢木霉菌T6CnA基因表達(dá)上調(diào)，而SidA基因表達(dá)量下降。說(shuō)明鈉鹽和鈣脅迫可以調(diào)控棘孢木霉菌T6CnA基因與SidA基因。另外，高pH下鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因表達(dá)量高于低pH，該結(jié)果與玉米黑粉病菌(Ustilagomaydis) 鈣調(diào)磷酸酶2個(gè)亞基UmEna1和UmEna2基因受高pH 誘導(dǎo)[21]的結(jié)果相一致。

嗜鐵素的合成常常受菌體內(nèi)部信號(hào)途徑的調(diào)控，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于真菌鈣調(diào)磷酸酶基因與嗜鐵素基因相互關(guān)系的研究并不多。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，sidA基因是棘孢木霉合成嗜鐵素的關(guān)鍵基因之一，且參與調(diào)控木霉的生長(zhǎng)和脅迫抗性[22]。在米根霉(Rhizopusoryzae) 中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑參與并調(diào)節(jié)缺鐵脅迫[23]，而缺鐵脅迫又能促進(jìn)嗜鐵素的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑CsA處理提高了嗜鐵素產(chǎn)量，這與半定量PCR結(jié)果一致，即高鹽脅迫和高pH下嗜SidA基因與CnA基因表達(dá)呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，但具體分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。