芽孢桿菌NCB-01胞外蛋白酶酶學(xué)特性的初步研究

孫藝軒，鄭國(guó)棟，林 劍

（煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái)264003）

蛋白酶是非常重要的一種水解酶，在所有的工業(yè)酶制劑中，蛋白酶大約占據(jù)75%，是最大最重要的工業(yè)用酶類之一，蛋白酶制劑的銷售總量占世界酶制劑銷售量的60%以上[1-2]。其中堿性蛋白酶的銷售份額又占整個(gè)蛋白酶市場(chǎng)的40%左右，是目前需求量最大的酶類[3]。

海洋因其極端的生存環(huán)境，使海洋微生物具有豐富的優(yōu)于陸生生物的酶基因及物理特性，這些特點(diǎn)極大的促進(jìn)了人類對(duì)于海洋生物新酶源的開發(fā)與利用[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選主要集中在陸地微生物，而海洋微生物產(chǎn)堿性蛋白酶的研究卻相對(duì)較少[5]。近年來，國(guó)內(nèi)外越來越多的學(xué)者都相繼開始將目光投向海洋，以期利用海洋環(huán)境的特點(diǎn)，從深海微生物中開發(fā)出更多新功能蛋白酶類[6-8]。中國(guó)科學(xué)院海岸帶研究所從渤海海域沉積物中分離得到一枝能夠分泌胞外蛋白酶的菌株7-5，通過對(duì)該菌株的形態(tài)特征、生理生化、16S rDNA序列比對(duì)等系統(tǒng)研究表明該菌株是海洋獨(dú)有的芽孢桿菌屬[9]，本研究將其命名為NCB-01。初步研究表明該菌株既能水解酪蛋白又對(duì)明膠蛋白具有一定的水解能力，其胞外蛋白酶屬于海洋微生物堿性蛋白酶，搖瓶培養(yǎng)后發(fā)酵液中的酶活力可以達(dá)到53.09 U/mL，但其酶學(xué)性質(zhì)是未知的。

本研究以菌株NCB-01的發(fā)酵液為原料，對(duì)其所分泌的胞外蛋白酶經(jīng)過一系列的分離純化后，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，以進(jìn)一步明確該酶的酶學(xué)特征，為該蛋白酶的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及海水菌株NCB-01：煙臺(tái)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保存；海水：渤海海水經(jīng)沉積后取用。

1.1.2 試劑

二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-瓊脂糖凝膠（Sepharose）fast flow（FF）陰離子交換層析柱：北京索萊寶科技有限公司；Tris、酪素等所有常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母提取物0.25%、蛋白胨0.5%，海水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉0.25%、酪素1.5%、明膠2.5%，海水配制。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5000型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；PHS—3C型酸度計(jì)：意大利哈納公司；20PR-52D型高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；BONA-GM-18型有機(jī)膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī)：濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司；SBS-100型數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株NCB-01種子液及發(fā)酵液的制備

種子液的制備：將菌株NCB-01接入種子培養(yǎng)基，在25 ℃、180 r/min下培養(yǎng)24 h，即得種子液。

發(fā)酵液的制備：將菌株NCB-01種子液按照接種量10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在pH 8.0、25 ℃、180 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h，即得發(fā)酵液。

1.3.2 酶的分離純化

將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min后取上清液，首先利用截留分子質(zhì)量30 kDa的聚醚砜（polyethersulfone，PES）超濾膜進(jìn)行一級(jí)超濾得透過液，再利用截留分子質(zhì)量20 kDa的PES膜進(jìn)行二級(jí)超濾得截留液，酶液濃縮后進(jìn)行DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析，收集有酶活性的組分檢測(cè)其純度并用于酶學(xué)特性研究。

1.3.3 酶反應(yīng)最適作用溫度

將1 mL酶液與1 mL 2%酪蛋白底物分別在5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴中反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活力。以最高酶活力為100%，其他條件下酶活力與之相比較，計(jì)算相對(duì)酶活力，下同。

1.3.4 酶的熱穩(wěn)定性

將1 mL酶液分別在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃保溫，每個(gè)溫度條件下放6個(gè)樣品，每隔20 min取出一個(gè)樣品管，放入冰水冷卻后測(cè)定酶活力，以未經(jīng)過熱保溫的酶液作為空白對(duì)照（100%），計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.5 酶的最適作用pH

將純化后的蛋白酶在不同pH 5.0～12.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH值。所用緩沖液為：Na2HPO4-CA緩沖液（pH 5.0），Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.0、7.0），Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），Gly-NaOH緩沖液（pH 9.0、10.0），Na2HPO4-NaOH緩沖液（pH 11.0、12.0）

1.3.6 酶的pH穩(wěn)定性

將1 mL酶液加入等體積的不同pH緩沖液中，于60 ℃保溫1 h后，按1.3中方法測(cè)定剩余蛋白酶的活力。

1.3.7 金屬離子對(duì)酶活力的影響

向 酶 液 中 加 入 用 蒸 餾 水 配 制 的Fe3+、Fe2+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+的鹽溶液，使金屬離子的終濃度為5 mmol/L，放置1 h后，按1.3中方法測(cè)蛋白酶活力。以不加金屬離子的酶液為對(duì)照，即設(shè)為100%。

1.3.8 蛋白酶抑制劑對(duì)酶活力的影響

在酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH條件下，分別加入乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）及苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白酶抑制劑，使試劑終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L，以不加抑制劑的酶液為空白對(duì)照（100%）。

1.3.9 表面活性劑對(duì)酶活力的影響

向酶液中加入各種表面活性劑，并使各試劑終濃度為：吐溫-20體積分?jǐn)?shù)10%，吐溫-80體積分?jǐn)?shù)10%，TritonX-100體積分?jǐn)?shù)10%，Span-80體積分?jǐn)?shù)10%，十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）5 mmol/L。以不加表面活性劑的酶液為空白對(duì)照（100%）。

1.3.10 鹽濃度對(duì)酶活力的影響

向酶液中加入一定量的NaCl，使反應(yīng)體系中NaCl終質(zhì)量濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、100 mg/mL，分別測(cè)定各鹽度下的酶活，以不加NaCl的酶液為對(duì)照，此時(shí)酶活設(shè)為100%。

1.3.11 堿性蛋白酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的酪蛋白溶液。向1 mL各酪蛋白溶液中加入1mL的酶液，在最適條件下反應(yīng)10min，測(cè)定酪氨酸濃度，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法作圖，可計(jì)算出以酪蛋白為底物時(shí)的堿性蛋白酶的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）。

1.3.12 測(cè)定方法

蛋白酶酶活力的測(cè)定：采用Folin-酚顯色法測(cè)定蛋白酶的活力[10]。蛋白酶酶活定義：在40 ℃、pH 8.0條件下，每毫升液體酶水解酪蛋白每分鐘釋放1 μg酪氨酸所需要的酶量稱為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-陰離子交換層析

由圖1可以看出，在整個(gè)洗脫過程中出現(xiàn)了三個(gè)較大的蛋白峰和兩個(gè)蛋白酶活力峰。經(jīng)檢測(cè)，蛋白峰處都沒有蛋白酶酶活力，而酶活峰2處雖然有酶活力，但酶活力較低且蛋白含量較高。在0 mol/L NaCl洗脫階段，出現(xiàn)了蛋白酶活力峰1，此處不僅酶活力較高且蛋白含量較少，說明蛋白酶組分并沒有被填料有效的吸附，但雜蛋白是被吸附了的，達(dá)到了分離的目的。

圖1 DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析圖Fig. 1 Chromatography of DEAE Sepharose FF ion exchange column

2.2 堿性蛋白酶純化結(jié)果

表1 菌株NCB-01產(chǎn)堿性蛋白酶的純化步驟及結(jié)果Table 1 Purification procedures and results of alkaline protease from strain NCB-01

由表1可知，發(fā)酵上清液在經(jīng)過一級(jí)超濾、二級(jí)超濾和DEAE-陰離子交換層析后，比活力由最初的838.36 U/mg提高至2 320.85 U/mg，純度提高了2.77倍，酶得率為24.46%，實(shí)現(xiàn)了有效的分離純化。

2.3 堿性蛋白酶的最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

2.3.1 堿性蛋白酶的最適作用溫度

圖2 溫度對(duì)堿性蛋白酶活性的影響Fig. 2 Effect of temperature on alkaline protease activity

由圖2可知，當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，酶活力隨著溫度的升高而升高；在溫度高于60 ℃后，酶活力則隨溫度的升高而下降。在60 ℃時(shí)酶活力最高，為該酶的最適作用溫度。在40～70 ℃范圍內(nèi)，酶的活性都較強(qiáng)，相對(duì)酶活力都在80%以上。當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí)，隨著溫度的降低，酶活力也下降顯著，在20 ℃時(shí)已下降至30%左右，但在5 ℃條件下仍保持了12.0%的酶活力，這說明菌株NCB-01所產(chǎn)堿性蛋白酶對(duì)海洋低溫環(huán)境有一定的適應(yīng)性。

目前市場(chǎng)上常用的2709堿性蛋白酶其最適作用溫度為50 ℃，在40 ℃條件下保溫2 h后仍保持80%以上的酶活力[11-12]。這與本實(shí)驗(yàn)中菌株NCB-01所產(chǎn)堿性蛋白酶的性質(zhì)相近，說明菌株NCB-01所產(chǎn)堿性蛋白酶也可進(jìn)一步投入生產(chǎn)。

2.3.2 堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性

圖3 堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermostability of alkaline protease

由圖3可知，該堿性蛋白酶分別在10～40 ℃水浴條件下保溫2 h，具有80%以上的酶活力，說明該酶在此溫度范圍內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性。尤其在10～30 ℃保溫2 h，酶活力基本沒有損耗，殘余酶活達(dá)到95%及以上。在20 ℃時(shí)，隨著在水浴中保溫時(shí)間的增長(zhǎng)，該堿性蛋白酶的酶活力沒有下降反而有所上升，保溫60 min后，酶活力提高了12.32%?？赡苁且?yàn)樵谠摐囟认?，底物與酶的空間結(jié)構(gòu)更加契合，促進(jìn)了二者之間的反應(yīng)，在一定程度上提高了該酶的酶活力。在50 ℃下該酶也具有較好的熱穩(wěn)定性，隨著保溫時(shí)間的增長(zhǎng)，酶活力逐漸降低，2 h后殘余酶活力為70.94%。而當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，該酶的熱穩(wěn)定性很差，在20～30 min達(dá)到了半衰期，保溫40 min后，殘余酶活僅為13.84%。

由以上結(jié)果可知，雖然該堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃左右，但其在低溫下仍具有良好的熱穩(wěn)定性，這就使得該酶具備了低溫蛋白酶的特性，說明菌株產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性與菌株生長(zhǎng)的環(huán)境溫度密切相關(guān)[13]，這就為常溫條件下或者低溫條件下使用該酶創(chuàng)造了條件。

2.4 堿性蛋白酶的最適作用pH及穩(wěn)定性

2.4.1 堿性蛋白酶的最適作用pH

由圖4可知，當(dāng)pH值＜8.0時(shí)，酶活力隨pH值的升高而升高；當(dāng)pH＞8.0時(shí)，酶活力隨pH的升高而降低。當(dāng)pH 8.0時(shí)，酶活力最高，因而該蛋白酶的最適作用pH值為8.0左右，屬于堿性蛋白酶，這體現(xiàn)了其對(duì)海洋弱堿性生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)。且在pH 7.0～10.0范圍內(nèi)，酶活力較高，相對(duì)酶活力均在75%以上，說明該酶為具有較寬pH值范圍的堿性蛋白酶，因而在洗滌、制革及絲綢等領(lǐng)域具有潛在的商業(yè)價(jià)值。在pH為12.0的強(qiáng)堿環(huán)境中，該酶仍保有一定酶活力，其殘余酶活力為41.14%。而在pH值為5.0的弱酸性條件下，酶活力則較低，相對(duì)酶活僅為24.24%。

圖4 pH值對(duì)堿性蛋白酶活性的影響Fig. 4 Effect of pH on alkaline protease activity

2.4.2 堿性蛋白酶的pH值穩(wěn)定性

由圖5可知，在pH值7.0～9.0范圍內(nèi)，該堿性蛋白酶具有良好的穩(wěn)定性，其相對(duì)酶活性均在90%以上，酶活力損失很小。在pH值高于9.0后，酶穩(wěn)定性隨pH值的升高逐漸降低，但在極堿條件（pH 12.0）下，其殘余酶活仍有62.88%。說明該堿性蛋白酶在堿性環(huán)境中較為穩(wěn)定。而當(dāng)pH值低于7.0時(shí)，酶的穩(wěn)定性明顯降低，在弱酸性條件（pH 5.0）中保溫1 h后，其殘余酶活僅為30.0%，說明該堿性蛋白酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較差。

圖5 pH值對(duì)堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of pH value on alkaline protease stability

2.5 金屬離子對(duì)堿性蛋白酶活性的影響

由圖6可知，不同的金屬離子對(duì)該堿性蛋白酶的影響不同。在5 mmol/L的濃度下，F(xiàn)e3+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活性均有抑制作用，且Zn2+的抑制作用最強(qiáng)，可以抑制70%的活性，Cu2+能抑制40%的活性，而Fe3+的抑制作用較弱，僅為12%。Fe2+、K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+能夠不同程度的促進(jìn)酶活性，且Fe2+、K+、Mn2+、Ca2+的激活作用較明顯，其中Ca2+的激活作用最強(qiáng)，可以使酶活性提高約40%，其他三種離子也能使酶活提高約13%～20%。由細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶在Ca2+、Mg2+或Mn2+存在時(shí)可以提高酶的活性和熱穩(wěn)定性，說明這些金屬離子在高溫下防止變性時(shí)具有一定作用，能夠防止蛋白酶催化活性中心構(gòu)象的改變[14]。Na+、Mg2+的促進(jìn)作用不明顯，對(duì)酶活性影響不大。

圖6 不同金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響Fig. 6 Effect of different metal ions on alkaline protease activity

2.6 蛋白酶抑制劑對(duì)酶活力的影響

兩種抑制劑乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）對(duì)酶活影響結(jié)果見表2。

表2 不同的蛋白酶抑制劑對(duì)堿性蛋白酶活力的影響Table 2 Effect of different protease inhibitors on alkaline protease activity

由表2可知，EDTA對(duì)酶活性的抑制作用較弱，當(dāng)其濃度為5 mmol/L時(shí)，酶活力仍有88%，沒有被完全抑制。說明金屬離子對(duì)酶活力有一定的作用，但不是蛋白酶水解蛋白所必須的。該堿性蛋白酶中可能有共價(jià)的金屬離子存在，這些金屬離子被螯合劑剝奪從而導(dǎo)致酶活下降。這與2.5中結(jié)果只有部分金屬離子激活酶活性一致。PMSF對(duì)該蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，當(dāng)其濃度為5 mmol/L時(shí)，抑制率就達(dá)到了90%以上。PMSF對(duì)絲氨酸有專一性[15]，說明該堿性蛋白酶的活性中心含有絲氨酸殘基，因此該蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類。PMSF能有效抑制酶的活性，從而能夠阻遏其斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，這也能證明蛋白酶大分子間的正確折疊與加工[16]。

2.7 表面活性劑對(duì)堿性蛋白酶活性的影響

由圖7可知，非離子型表面活性劑Tween-20、Tween-80及TritonX-100對(duì)該堿性蛋白酶均有較強(qiáng)的抑制作用，且抑制作用強(qiáng)弱為TritonX-100＞Tween-80＞Tween-20。TritonX-100可能是對(duì)酶活性中心區(qū)域的疏水區(qū)產(chǎn)生了破壞作用，從而導(dǎo)致酶活力的下降[17]。Tween-20和Tween-80可能使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生反應(yīng)或吸附聚集而使酶活下降[18]。同樣是非離子型表面活性劑，Span-80對(duì)酶幾乎沒有影響。陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對(duì)酶活性的抑制作用較為明顯，使酶活減小了近一半，可能是CTAB與酶聚合形成復(fù)合物從而使酶活下降。

圖7 表面活性劑對(duì)堿性蛋白酶活性的影響Fig. 7 Effect of surfactants on alkaline protease activity

2.8 鹽濃度對(duì)蛋白酶活性的影響

因菌株NCB-01來源于渤海沉積物，因此該菌株所產(chǎn)蛋白酶的耐鹽性值得研究。如圖8所示，在NaCl質(zhì)量濃度為0～100 mg/mL范圍內(nèi)，蛋白酶的活力隨鹽濃度的不斷升高而逐漸降低，但仍保持了較高的酶活力。當(dāng)鹽濃度為100 mg/mL時(shí)，其殘余酶活力仍有73.2%。說明該堿性蛋白酶具有良好的耐鹽性，從而體現(xiàn)了菌株NCB-01對(duì)海洋環(huán)境的適應(yīng)性。這與深海菌株Exiguobacteriumsp.SWJS2所產(chǎn)蛋白酶具有一定的耐鹽性相一致[19]。

圖8 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)堿性蛋白酶活性的影響Fig. 8 Effect of NaCl mass concentration on alkaline protease activity

2.9 堿性蛋白酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

米氏常數(shù)（Km）是常用的酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，它表示酶反應(yīng)速率（V）為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度，其大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)，Km值越小，表示酶與底物的親和力越大。如圖9所示，采用Lineweaver-Burk法，以1/[S]為橫坐標(biāo)，以1/V為縱坐標(biāo)作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，由此可計(jì)算得出，當(dāng)以酪蛋白為底物時(shí)，該堿性蛋白酶的米氏常數(shù)（Km）為1.11 mg/mL，最大反應(yīng)速率（Vmax）為91.74 μg/（min·mL）。說明該堿性蛋白酶與酪蛋白的親和力好，特異性強(qiáng)。

圖9 堿性蛋白酶水解酪蛋白的Lineweaver-Burk圖Fig. 9 Lineweaver-Burk plot of casein hydrolysis by alkaline protease

廣泛應(yīng)用于食品、洗滌及制革等行業(yè)的Alcalase2.4L堿性蛋白酶其米氏常數(shù)Km為2.437 mg/mL[20]。而菌株NCB-01所產(chǎn)堿性蛋白酶其Km為1.11 mg/mL，Km值相比Alcalase2.4L更小，說明當(dāng)以酪蛋白為底物時(shí)，菌株NCB-01所產(chǎn)堿性蛋白酶比Alcalase2.4L堿性蛋白酶對(duì)蛋白的水解效果更好。

3 結(jié)論

該海洋菌株所產(chǎn)蛋白酶具有良好的耐鹽性。雖然其最適溫度為60 ℃，屬于中溫蛋白酶，但在10～40 ℃的低溫條件下具有良好的熱穩(wěn)定性，最適pH值為8.0，在50 ℃以下的低溫環(huán)境中該酶可以較好的保持酶活性，在pH值7.0～9.0的范圍內(nèi)也可以保持良好的酶穩(wěn)定性。該酶具有較好的金屬離子耐受能力，F(xiàn)e2+、K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+對(duì)酶活均有不同程度的激活作用。絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑（PMSF）能強(qiáng)烈抑制該酶的酶活性，表明該蛋白酶為絲氨酸堿性蛋白酶。非離子型表面活性劑Tween-20、Tween-80及TritonX-100和陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對(duì)酶活均有較強(qiáng)的抑制作用。該酶具有良好的耐鹽性。其米氏常數(shù)（Km）為1.11 mg/mL，最大反應(yīng)速率（Vmax）為91.74 μg/（min·mL），說明該堿性蛋白酶與酪蛋白的親和力好，特異性強(qiáng)。這些優(yōu)良特性使該蛋白酶在食品、洗滌劑等領(lǐng)域有著潛在應(yīng)用價(jià)值。