響應面法優(yōu)化紅曲霉發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝

何珺珺，時 偉，李 喆，甘廣東

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷564501）

白酒作為我國傳統(tǒng)蒸餾酒，2019年產(chǎn)量達到785.95萬kL。白酒在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的酒糟，研究發(fā)現(xiàn)，白酒與酒糟的產(chǎn)量比為1∶3[1]，預計2019年我國白酒酒糟的年產(chǎn)量可達到約2.4×107t。酒糟作為釀酒產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物，其中含有很多未被利用的粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪及有機酸類物質(zhì)。酒糟中粗淀粉含量為6.77%，粗蛋白含量為13.28%，粗脂肪含量為2.51%[2]。酒糟產(chǎn)量大，酸度高，其生化需氧量約為25 000～35 000 mg/L，化學需氧量約為35 000～50 000 mg/L，如果處理或利用不當，易腐爛、變質(zhì)、發(fā)臭，造成環(huán)境污染和資源浪費[3-4]。如何高效利用酒糟是各白酒企業(yè)一直在探索的問題。目前，酒糟再利用的常見方法有生產(chǎn)飼料、作為菌菇類生長載體、生產(chǎn)有機肥、生產(chǎn)沼氣、釀造食用醋、提取蛋白酶等[5-6]。傳統(tǒng)的酒糟利用方法存在附加值低、預處理能耗高、二次污染等問題[7]。利用微生物處理酒糟以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品（如植酸、丁二酸、洛伐他汀等），有利于提高酒糟的利用價值和增加酒糟循環(huán)利用的經(jīng)濟效益[8-9]。

洛伐他汀是一種聚酮類物質(zhì)，有兩種結(jié)構(gòu)形態(tài)，分別為酸型和內(nèi)酯型，兩種形態(tài)可相互轉(zhuǎn)化[10-11]。其對膽固醇合成限速酶-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）具有高效抑制作用，從而具有抑制膽固醇合成，控制高血脂的功效[12-13]。還具有保護內(nèi)皮祖細胞、抗血栓、抑制腫瘤細胞增殖等功能[14]。微生物來源的洛伐他汀主要以紅曲霉或土曲霉為菌種，大米、小米、大豆、青稞、黃精渣、花生、甘蔗渣等為培養(yǎng)基采用固態(tài)或液態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)[15-16]。目前，利用紅曲菌生產(chǎn)洛伐他汀的方法主要有固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法[17]。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法使用的基質(zhì)為大米[18]，其中洛伐他汀的含量可達到14.54 mg/g。也有科研工作者以甘薯、木薯為基質(zhì)生產(chǎn)洛伐他汀[19-20]。

為了研究紅曲霉發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀的效果，該研究采用固態(tài)發(fā)酵法，以茅臺醬香型白酒酒糟作為基質(zhì)，以紅曲霉為菌種，并利用響應面法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，降低了生產(chǎn)成本，有效利用了白酒工業(yè)釀造副產(chǎn)物。1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

醬香型白酒酒糟：茅臺集團；紅色紅曲霉（Monascns ruber）CICC 41649：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基[21]：5°Bé麥芽汁1 L，瓊脂15 g，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

種子培養(yǎng)基[22]：葡萄糖60 g/L，蛋白胨25 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基[23]：干酒糟（含水量12%）84%，麩皮15%，硫酸銨0.5%，KH2PO40.2%，MnSO40.1%，ZnSO40.2%，混勻，調(diào)整初始含水量為40%。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌30 min。

1.1.3 試劑

洛伐他汀（純度≥98%）：美國Sigma公司；瓊脂、葡萄糖、蛋白胨（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、磷酸（均為分析純）：成都科隆化工試劑廠；乙腈（色譜純）：美國DIMA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PYX-XHS-40J電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；Waterse2695高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀：美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟

將4 ℃保藏菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。挑取孢子接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3 d作為種子液。

將種子液按20%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝料量20 g/500 mL，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，25 ℃培養(yǎng)20 d，每3 d扣瓶一次。

1.3.2 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化單因素試驗

采用單因素輪換法，依次考察培養(yǎng)基裝料量（20g/500mL、40 g/500 mL、60 g/500 mL、80 g/500 mL、100 g/500 mL）、接種量（12%、16%、20%、24%、28%、32%）、培養(yǎng)基初始含水量（40%、45%、50%、55%、60%）、分段發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、發(fā)酵時間（5～21 d）對紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀的影響。

1.3.3 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理及姜冰潔[24]的研究，選擇裝料量（A）、接種量（B）、初始含水量（C）為自變量，以洛伐他汀產(chǎn)量（Y）為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for process optimization of lovastatin production from distillers' grains by solid-state fermentation of Monascus

1.3.4 洛伐他汀含量檢測方法

發(fā)酵樣品預處理：取發(fā)酵樣品70～80 ℃烘干后研磨過篩，取0.5 g于50 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為70%的乙醇定容至50 mL，55 ℃水浴超聲萃取1 h，待測液經(jīng)有機濾膜過濾后，取上清液，采用HPLC法測定洛伐他汀含量[25]。

HPLC條件：AthenaC18-WP色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫（30±0.5）℃，流動相為乙腈∶0.1%磷酸溶液=65∶35（V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長238 nm。根據(jù)洛伐他汀標準品的保留時間進行定性，外標法定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 7.5進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 23.0和Design-Expert 8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 培養(yǎng)基裝料量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基裝料量對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖1。

圖1 裝料量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of charge on lovastain production

裝料量對物料發(fā)酵具有重要影響，裝料量太多影響通氣，不利于紅曲霉孢子絲的生長，同時造成培養(yǎng)基的浪費。裝料量太少不能滿足紅曲霉生長繁殖的營養(yǎng)需要。由圖1可知，隨著裝料量的增加，洛伐他汀產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當裝料量為40 g/500 mL時，洛伐他汀產(chǎn)量達到最大，為5.573 mg/g。當裝料量＞40 g/500 mL后，隨著裝料量的增加，洛伐他汀產(chǎn)量反而降低。原因可能是紅曲霉在代謝過程中產(chǎn)生的熱量影響紅曲霉的次級代謝；也有可能是通氣性較差，影響紅曲霉的生長和繁殖。因此，確定培養(yǎng)基最佳裝料量為40 g/500 mL。

2.1.2 接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

接種量對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖2。

圖2 接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of inoculum on lovastain production

由圖2可知，隨著接種量的增加，洛伐他汀產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當接種量＜24%時，洛伐他汀產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加，原因可能是紅曲霉孢子生長速度快，代謝活動旺盛。當接種量為24%時，洛伐他汀產(chǎn)量達到最大值，為6.247 mg/g。當接種量＞24%時，隨著接種量的增加，洛伐他汀產(chǎn)量下降，原因可能是接種量過大，有限的營養(yǎng)物質(zhì)被用于供給紅曲霉孢子的生長，不利于次級代謝和洛伐他汀的合成。因此，確定最佳接種量為24%。

2.1.3 培養(yǎng)基初始含水量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基初始含水量對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖3。

圖3 初始含水量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of initial water contents on lovastain production

水對微生物的代謝活動有較大影響，初始含水量是影響紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的重要因素之一，含水量太低，培養(yǎng)基干燥、松散，不利于菌體的生長；含水量太高，培養(yǎng)基易結(jié)塊，不利于紅曲霉代謝。由圖3可知，隨著培養(yǎng)基初始含水量的增加，洛伐他汀產(chǎn)量先增加后減少，當初始含水量為55%時，洛伐他汀產(chǎn)量達到最大值，為6.527 mg/g。因此，確定最佳初始含水量為55%。

2.1.4 發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on lovastain production

由圖4可知，發(fā)酵溫度對洛伐他汀產(chǎn)量有較大影響，紅曲霉經(jīng)過30 ℃培養(yǎng)3 d后，在變溫培養(yǎng)過程中，隨著溫度的升高，洛伐他汀產(chǎn)量先增加后減少，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，洛伐他汀產(chǎn)量最高，為6.687 mg/g。因此，確定紅曲霉最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.5 發(fā)酵時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時間對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on lovastain production

洛伐他汀的產(chǎn)量是一個積累的過程。由圖5可知，從發(fā)酵第5天開始，洛伐他汀產(chǎn)量快速增加；發(fā)酵10 d后，洛伐他汀產(chǎn)量的增長速度變慢；發(fā)酵17 d時，洛伐他汀產(chǎn)量達到峰值，為6.777 mg/g；發(fā)酵17 d以后，洛伐他汀產(chǎn)量減少。因此，確定洛伐他汀的最佳培養(yǎng)時間為17 d。

2.2 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟產(chǎn)洛伐他汀工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 模型的建立及方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定分段發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間17 d，選擇影響較大的因素培養(yǎng)基裝料量（A）、接種量（B）、初始含水量（C）3個因素為變量，洛伐他汀產(chǎn)量（Y）為響應值，進行3因素3水平的響應面分析試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2的試驗結(jié)果進行二次線性回歸擬合，得到多元二次回歸方程：Y=6.80+0.71A+0.66B+0.68C+0.31AB+0.13AC+0.021BC-1.97A2-2.32B2-1.79C2。

由表3可知，回歸模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項P值=0.065 8，不顯著，說明所構(gòu)建的模型合適。該模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.980 4，表示能較好地預測實際發(fā)酵情況，可用該模型來預測紅曲霉發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀。一次項A、B、C及二次項A2、B2、C2對洛伐他汀產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。通過F值可知，3個因素對洛伐他汀產(chǎn)量影響的主次順序為A＞C＞B，即裝料量＞初始含水量＞接種量。

2.2.2 響應面分析

利用Design-Expert8.0.6軟件得到裝料量、初始含水量及接種量間交互作用的響應面和等高線，結(jié)果見圖6。

圖6 各因素間交互作用對洛伐他汀產(chǎn)量影響的響應面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on lovastain production

由圖6可知，接種量、裝料量和初始含水量3個因素之間兩兩交互作用的響應曲面呈凸面，說明存在最高點；等高線趨于圓形，說明這些因素之間的交互作用不顯著。從等高線圖中軸向等高線變化密集程度可知，裝料量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響＞初始含水量，接種量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響最小，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝的確定及驗證

通過對回歸方程進行分析，響應面優(yōu)化紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀的最優(yōu)條件為裝料量44.90 g/500 mL，接種量24.51%，初始含水量56.05%，在此條件下30 ℃發(fā)酵3d后，28℃發(fā)酵17d，洛伐他汀產(chǎn)量的理論值達到6.981mg/g?？紤]到實際操作可行性，將最優(yōu)發(fā)酵工藝修訂為裝液量45 g/500 mL，接種量25%，初始含水量56%。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下進行重復驗證試驗，洛伐他汀產(chǎn)量實際值為（6.97±0.05）mg/g，與預測值接近，證明響應面優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝條件合理可靠。

3 結(jié)論

本研究采用紅曲霉固態(tài)發(fā)酵酒糟生產(chǎn)洛伐他汀，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應面試驗優(yōu)化得到紅曲霉發(fā)酵酒糟制備洛伐他汀的最優(yōu)條件為裝料量45 g/500 mL，接種量25%，初始含水量56%，分段發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間17 d，在此優(yōu)化條件下，洛伐他汀產(chǎn)量為（6.97±0.05）mg/g，是優(yōu)化前的1.3倍。本研究為酒糟等工業(yè)廢棄物的資源化利用提供參考。