遠(yuǎn)志薄層色譜鑒別及生物自顯影色譜篩選研究*

劉雅晴，魏 巍，段 琦，袁 宇，王海波

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

遠(yuǎn)志作為臨床常用藥，來(lái)源為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd.或卵葉遠(yuǎn)志P.sibirica L.的干燥根，具有安神益智，交通心腎，祛痰，消腫等功效[1]。臨床用于治療心腎不交引起的失眠多夢(mèng)、健忘驚悸、咳痰不爽等，含有三萜皂苷、寡糖酯以及酮等類型成分[2]。市售遠(yuǎn)志飲片以栽培品種為主，因產(chǎn)地不同、生長(zhǎng)年限差異等原因，質(zhì)量參差不齊。市場(chǎng)流通時(shí)多根據(jù)外觀性狀進(jìn)行分級(jí)銷售，難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥效作用情況。遠(yuǎn)志藥材成分復(fù)雜，對(duì)分離條件要求較高，在前期研究中[3]，采用高效液相色譜分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)志中含量較高、活性研究較深入的多種活性成分或質(zhì)量標(biāo)志成分含量的共同測(cè)定，但遠(yuǎn)志的薄層色譜鑒別研究還不夠深入。2015年版藥典對(duì)遠(yuǎn)志酮Ⅲ和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷兩個(gè)指標(biāo)成分分別進(jìn)行薄層色譜鑒別，操作過(guò)程繁瑣，并未實(shí)現(xiàn)多種成分的同時(shí)鑒別評(píng)價(jià)。進(jìn)行遠(yuǎn)志多成分薄層色譜研究，提高遠(yuǎn)志薄層色譜鑒別易用性，有助于加強(qiáng)遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)管理。

乙酰膽堿酯酶抑制劑是目前治療阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）效果較好的一類藥物[4，5]，遠(yuǎn)志成分在AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面具有較多的應(yīng)用，采用薄層色譜生物自顯影法，篩選遠(yuǎn)志抗乙酰膽堿酯酶（AChE）活性成分，可以尋找其中具有治療AD作用的先導(dǎo)化合物，有助于發(fā)現(xiàn)其藥效物質(zhì)成分。

本課題利用薄層色譜法[6-8]對(duì)遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行定性分析，找出遠(yuǎn)志藥材薄層色譜鑒別特征及質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，為遠(yuǎn)志的等級(jí)劃分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供研究支持。通過(guò)薄層色譜生物自顯影技術(shù)分析篩選出遠(yuǎn)志藥材中抑制AChE酶活性成分[9]，篩選天然AChE酶抑制劑，為遠(yuǎn)志活性成分開(kāi)發(fā)提供支持。

1 儀器與材料

2F-2C型暗箱式自動(dòng)紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）；B-260恒溫水浴鍋，移液槍（上海蘇陽(yáng)儀器有限公司）；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Linomat5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司）；Visualizer自動(dòng)薄層色譜分析儀（瑞士卡瑪公司）；CP225D十萬(wàn)分之一天平（SARTORIUS）；ACCULABALC-110.4 萬(wàn) 分 之 一 天 平（SARTORIUS）。

硅膠G（中國(guó)青島海洋化工）；甲醇（色譜純 天津大茂化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純天津市大茂化學(xué)試劑廠）；H3PO4（AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;純凈水（遼東半島飲用純凈水有限公司）;遠(yuǎn)志皂苷元（批號(hào)：150122）、3,6′-二芥子?；崽牵ㄅ?hào)：CHB150706）、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（批號(hào)：141027）購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司；遠(yuǎn)志糖苷A（批號(hào)：160125）、遠(yuǎn)志酸（批號(hào)：141127）、遠(yuǎn)志皂苷 B（批號(hào)：150629）、遠(yuǎn)志酮Ⅲ（批號(hào)：150605）、遠(yuǎn)志糖苷 C（批號(hào)：160125）、西伯利亞遠(yuǎn)志糖 A6（批號(hào)：16081504）均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)純度均超過(guò)98.5%。遠(yuǎn)志藥材購(gòu)置于藥材公司或藥店，經(jīng)鑒別為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根，來(lái)源見(jiàn)表1。瓜子金藥材采于廣西北流市六麻鎮(zhèn)，經(jīng)鑒別為遠(yuǎn)志科植物瓜子金P.japonica Houtt.的干燥全草。

表1 遠(yuǎn)志藥材產(chǎn)地信息表Tab.1 Polygala origin information sheet

2 方法與結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志藥材的TLC鑒別

2.1.1 薄層色譜條件 硅膠G薄層板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10，下層溶液，冷凍分層）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和30min，在室溫條件下展開(kāi)，展距為 12～14cm。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱定遠(yuǎn)志糖苷A、遠(yuǎn)志皂苷元、3,6'-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酮Ⅲ對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含量分別是 0.6、0.6、0.4、1、0.2mg 的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志藥材樣品1g，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇25mL溶解，超聲30min，過(guò)濾，超聲提取兩次，合并兩次濾液，濾液用水浴鍋蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，4000r·min-1離心3min，上清液作為供試品溶液，備用。

2.1.4 TLC分析 精密吸取各供試品溶液及混合對(duì)照品溶液，條帶狀點(diǎn)樣2μL。展開(kāi)后，置紫外燈365nm下進(jìn)行檢視，再均勻噴以5%香草醛濃硫酸顯色劑，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 遠(yuǎn)志TLC結(jié)果圖Fig.1 Results of P.Radix TLC

結(jié)果表明，依據(jù)混合對(duì)照品可以看出，365nm下檢視，遠(yuǎn)志酮Ⅲ在Rf值0.23處顯黃色斑點(diǎn)，3,6'-二芥子?；崽窃赗f值0.36處顯藍(lán)色斑點(diǎn)，遠(yuǎn)志糖苷A在Rf值0.45處顯藍(lán)色斑點(diǎn)。5%香草醛濃硫酸顯色后檢視，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在Rf值0.14處顯紫色斑點(diǎn)，遠(yuǎn)志皂苷元在Rf值0.6處顯紫色斑點(diǎn)。

在12批遠(yuǎn)志供試品色譜中，Rf0.23黃色斑點(diǎn)（遠(yuǎn)志酮Ⅲ）、Rf0.36藍(lán)色斑點(diǎn)（3,6'-二芥子酰基蔗糖）、Rf0.45藍(lán)色斑點(diǎn)（遠(yuǎn)志糖苷A）與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)；但不同樣品色譜斑點(diǎn)略有差異。5%香草醛濃硫酸顯色后，6 份遠(yuǎn)志樣品（S1、S2、S7、S9、S12、S15）供試品色譜中，Rf0.14紫色斑點(diǎn)（細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷）與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)，其它樣品則未檢出；Rf0.6紫色斑點(diǎn)（遠(yuǎn)志皂苷元）均未檢出。

由薄層鑒別結(jié)果可知，在遠(yuǎn)志供試品溶液色譜中，365nm下可見(jiàn)12個(gè)清晰色譜斑點(diǎn)。本研究實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)志藥材中的遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志糖苷A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志皂苷元五種成分的良好分離和鑒別。其中，遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?；崽恰⑦h(yuǎn)志糖苷A 3個(gè)成分能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)志藥材的特征鑒別；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志皂苷元色譜斑點(diǎn)清晰程度，可用于評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志皂苷類活性成分質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

2.2 抑制AChE酶作用自顯影色譜研究

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取遠(yuǎn)志糖苷A、遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志皂苷元、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志汕酮Ⅲ、瓜子金皂苷己對(duì)照品適量，加甲醇或乙腈-水（7∶3）溶解，制成每 1mL 含量分別是 2、5、5、1、0.5、5mg的對(duì)照品溶液，備用。

精密稱取遠(yuǎn)志皂苷B、3,6'-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酸適量，加甲醇制成每1mL含量分別是 0.5、1、0.2、1mg的混合對(duì)照品溶液，備用，作為對(duì)照品溶液Ⅱ。

2.2.2 薄層自顯影分析 取遠(yuǎn)志樣品溶液、各對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液Ⅱ、瓜子金樣品溶液，按2.1.4項(xiàng)下方法點(diǎn)樣，展開(kāi)后，將薄層板取出，晾干。再用PBS（PH8.0）將薄層板噴濕，再均勻噴上AChE（1U·mL-1）和乙酸 β 萘酚（2.5mg·mL-1）。在 37℃濕潤(rùn)環(huán)境下孵育20min后，均勻噴上固藍(lán)B試劑（0.5mg·mL-1），顯色 5min。分析結(jié)果見(jiàn)圖 2。

自顯影色譜薄層板上，有抑制AChE酶活性化合物存在的部分呈現(xiàn)白色斑點(diǎn)，其他部分為紫色背景。結(jié)果表明,遠(yuǎn)志糖苷C在Rf值0.49處顯白色斑點(diǎn)，遠(yuǎn)志藥材在Rf值0.05處顯白色斑點(diǎn)，瓜子金藥材在Rf值0.07處顯白色斑點(diǎn)，其余對(duì)照品均未顯現(xiàn)出白色斑點(diǎn)。故遠(yuǎn)志糖苷C、遠(yuǎn)志藥材、瓜子金藥材對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用。本方法成功篩選出遠(yuǎn)志藥材中1個(gè)活性成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)遠(yuǎn)志藥材抑制乙酰膽堿酯酶作用的研究，為遠(yuǎn)志資源開(kāi)發(fā)乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物提供支持依據(jù)。

2.3 薄層色譜鑒別條件篩選

選擇分別進(jìn)行不同展開(kāi)劑的分離效果篩選，進(jìn)行不同組成的三氯甲烷-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-磷酸篩選。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所用展開(kāi)劑分離度更高，分離效果好，能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)志不同成分的分離和鑒別。薄層色譜分離實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)展開(kāi)溫度對(duì)遠(yuǎn)志藥材成分分離效果影響很大。顯色劑選擇考察了多種顯色劑，60%硫酸乙醇，10%硫酸乙醇，5%香草醛濃硫酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%香草醛濃硫酸顯色效果較好，色譜斑點(diǎn)清晰。

3 結(jié)論

（1）本研究利用薄層色譜法對(duì)遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行薄層定性分析，色譜圖斑點(diǎn)較為清晰，分離度高，鑒別效果好。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)12種不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行分離鑒別，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)志藥材中的遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志糖苷A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志皂苷元五種成分的良好分離和鑒別。其中，12組樣品中均能鑒別出遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志糖苷A 3個(gè)成分，故這3個(gè)成分能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)志藥材的特征鑒別；其中根據(jù)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志皂苷元色譜斑點(diǎn)清晰程度，可用于評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志皂苷類活性成分質(zhì)量?jī)?yōu)劣。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)薄層色譜鑒別可用于遠(yuǎn)志不同品種、不同采集期、不同制品及其偽品的鑒別評(píng)價(jià)。有助于藥典收載遠(yuǎn)志品種的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的提高，為遠(yuǎn)志的等級(jí)劃分及新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考依據(jù)，為其質(zhì)量規(guī)范化研究提供支持。

（2）薄層色譜-生物自顯影研究 生物自顯影色譜技術(shù)是一種集分離、鑒定和活性測(cè)定于一體的藥物篩選方法，篩選方法簡(jiǎn)便、快捷。采用薄層色譜生物自顯影技術(shù)可以高效快速地對(duì)植物提取物中具有AChE酶抑制活性的物質(zhì)進(jìn)行篩選[10]，活性成分可在薄層板上直觀顯現(xiàn)斑點(diǎn)，通過(guò)層析板上的斑點(diǎn)大致預(yù)計(jì)幾個(gè)具有高活性的抑制劑的存在。本文利用生物自顯影色譜分析遠(yuǎn)志藥材各成分對(duì)AChE酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志糖苷C對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用，為遠(yuǎn)志中AChE酶天然抑制劑的快速尋找和活性成分跟蹤研究提供幫助。