肺腺癌軟腦膜轉(zhuǎn)移患者的腦脊液和血液中不同的基因突變譜：基于循環(huán)腫瘤DNA的液體活檢

李會穎 謝宇 林永娟 俞婷婷 尹震宇

軟腦膜轉(zhuǎn)移（leptomeningeal metastasis, LM）是晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)生率約為3%-5%[1]。而在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變陽性的患者中，由于EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的廣泛使用，生存期得到明顯的延長，LM的發(fā)生率可達到9.4%[2]。LM的治療目前仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)有效的方案，患者的預(yù)后較差，中位生存期僅為3個月-11個月左右[3]。

對于驅(qū)動基因陽性的NSCLC患者，TKIs仍然是治療的首選，可以帶來明確的生存獲益[3]，但常伴隨著無法解決的耐藥問題。T790M是較為常見的耐藥突變，此外人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,erbB-2）、間質(zhì)-上皮細胞轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition factor,MET）等基因表達的擴增，腫瘤蛋白P53（tumor proteinp53gene,TP53）、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS）等基因的錯義突變，間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）及肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶1（ROSproto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase 1,ROS1）融合基因等都會對TKI的療效產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致耐藥從而病情進展[4]。因此在出現(xiàn)TKIs耐藥后，重新明確其轉(zhuǎn)移灶的基因突變狀態(tài)對于指導(dǎo)后續(xù)的治療顯得尤其重要。對于顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶，組織活檢由于標(biāo)本獲取困難及有創(chuàng)性，臨床應(yīng)用受限。而基于二代基因測序（next generation sequencing, NGS）的液體活檢技術(shù)，為肺癌精準(zhǔn)治療提供了更加安全、有效的途徑。液體活檢可通過檢測外周血、腦脊液（cerebrospinal fluid,CSF）等體液中的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA），判斷NSCLC患者的腫瘤負荷、藥物的療效以及耐藥情況[5]。此外有研究[6,7]證實CSF中的ctDNA相較于外周血，能更加準(zhǔn)確地反映顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的基因突變情況。

基于此，本研究通過ctDNA測序技術(shù)比較TKI耐藥后NSCLC患者同期的腦脊液及外周血中的基因突變譜和突變頻率，篩查相關(guān)的耐藥基因，探討耐藥機制，以期能預(yù)測療效并指導(dǎo)后續(xù)個體化的治療。

1 資料和方法

1.1 資料來源 本研究篩選了2013年1月-2019年10月期間就診于南京鼓樓醫(yī)院的經(jīng)病理明確診斷的NSCLC患者，其中42例經(jīng)頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）或腦脊液細胞學(xué)明確診斷為軟腦膜轉(zhuǎn)移，最終入組18例可獲取同期的腦脊液及外周血樣本的患者（詳細篩選流程見圖1），均已簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 檢測方法 患者入組后暫時停用TKIs，且不接受化療、放療或免疫治療。經(jīng)腰椎穿刺留取腦脊液約10 mL，抽取同期的外周血約8 mL于EDTA抗凝管中，并在2 h內(nèi)以2,000 rpm離心10 min分離血漿，然后統(tǒng)一保存于-80oC冰箱中。樣本借助南京世和基因生物技術(shù)有限公司提供的Qiagen DNA提取試劑盒提取ctDNA，超聲波將其破碎為300 bp-350 bp。經(jīng)96rxn xGen Exome Research Panel v1.0試劑盒富集后建立高通量測序文庫，再采用Illumina Hiseq高通量測序平臺進行深度測序，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。利用生物信息學(xué)平臺整合分析下機數(shù)據(jù)，最終生成樣本的突變信息。檢測共覆蓋139個肺癌相關(guān)基因的外顯子、融合相關(guān)內(nèi)含子、可變剪切區(qū)域及特定微衛(wèi)星位點區(qū)域等。質(zhì)控環(huán)節(jié)包括樣本制備、文庫構(gòu)建、靶向富集、樣本上機、高通量測序、數(shù)據(jù)質(zhì)控。要求樣本至少應(yīng)達到未損壞的DNA＞200 ng，ctDNA樣本提取總量＞50 ng，如經(jīng)質(zhì)控分析顯示損毀或不符合前述質(zhì)控要求的樣品將被退回。

圖 1 研究篩選流程圖Fig 1 Study flow chart.LM: leptomeningeal metastasis; NSCLC: non-small cell lung cancer; CSF: cerebrospinal fluid; NGS: next generation sequencing.

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 共納入18例NSCLC伴有LM的患者，年齡33歲-62歲，中位年齡48歲，男9例，女9例，男女比例1:1，共10例有吸煙史。從診斷為NSCLC至發(fā)生LM，時間為8個月-63個月，中位時間28.5個月；從開始接受TKIs治療到診斷LM的時間為5個月-34個月，中位時間為14個月；診斷LM時患者的美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）評分為1分-3分。18例患者中，3例（16.67%）腦脊液細胞學(xué)陰性，3例（16.67%）頭顱MRI陰性，18例（100.00%）腦脊液ctDNA的NGS檢測均陽性。所有患者均接受過TKIs的治療，6例（33.33%）合并腦實質(zhì)轉(zhuǎn)移（brain metastasis, BM）的患者中，4例接受了全腦放療（whole brain radiation therapy, WBRT）。相關(guān)內(nèi)容詳見表1。

2.2 腦脊液及外周血中的基因突變情況 18例患者的詳細基因突變情況見表2，其中EGFR、ALK、ROS1定義為基礎(chǔ)突變?；A(chǔ)突變中11例（61.11%）為EGFR，6例（33.33%）為ALK，1例（5.56%）為ROS1。18例（100.00%）CSF樣本的ctDNA均檢測到靶向的基因突變，而外周血中僅12例（66.67%）陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006）。此外，基礎(chǔ)突變基因的腦脊液豐度均明顯高于血漿豐度（均值33.78%vs1.58%），且差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖2）。

腦脊液樣本中檢測出較多的單核苷酸變異（singlenucleotide variations, SNV）和拷貝數(shù)變異（copy number variants, CNV）（圖3），數(shù)量均多于血液樣本（SNV: 64vs28, CNV: 11vs3），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.052,P=0.170），且發(fā)現(xiàn)了較多的獨有突變，例如No.1患者中MET（I214M），No.3患者中CDK4、SMARCA4（W922*）、MTOR（M1650I），No.4患者中LRP1B（V1432E）等（見表2）。此外，在檢測前使用多種靶向藥物的患者中，腦脊液和血液中SNV數(shù)目均多于僅接受過單一靶向藥物治療的患者（腦脊液：2.7vs1.4，外周血：4.63vs1.75），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.304,P=0.961）。

11例EGFR突變的患者中，6例（54.55%）為19del突變，5例（45.45%）為L858R突變。伴隨突變中，腦脊液TP53檢出率為63.64%（7/11），高于血液中的檢出率為54.55%（6/11）；其他突變類型包括EGFRT790M（2/11, 18.18%）、MET（1/11, 9.09%）陽性率較低，但這兩種突變在有TP53突變的患者中檢出率相對較高（42.86%vs0.00%）。

在6例ALK突變的患者中，5例均為EML4-ALK融合突變，這其中E13:E20有3例，E6:E20和E18:E20各1例。另外1例（No.16）同時存在較為少見的CNTNAP5-ALK（C2:A20）和WDR43-ALK（Wintergenic: A20）融合突變。此外這些患者中MET突變檢出率也相對較高（3/6, 50.00%）。

僅1例ROS1突變的患者，為CD74-ROS1（E6:E34）融合突變，在應(yīng)用克唑替尼、卡博替尼、勞拉替尼靶向治療后，均快速的產(chǎn)生耐藥，考慮與出現(xiàn)繼發(fā)性的耐藥突變ROS1（G2032R）錯義突變和NF1（A702H）移碼突變相關(guān)，而這兩種突變在該患者的血液樣本中均未能檢測出來。

表1 LM患者的基本情況Tab 1 Characteristics of patients with LM

3 討論

LM發(fā)生的中位時間約在TKIs開始使用后的14.2個月[2]，目前該病的治療仍較為棘手，需要制定個體化的治療方案，其中首要的是明確基因突變的狀態(tài)，如存在EGFR突變，可選擇奧希替尼、阿法替尼、厄洛替尼等TKIs，其中三代TKI奧希替尼因其良好的中樞穿透性和可靠的抗腫瘤效果[8]，不管患者是否存在EGFRT790M突變，均是推薦優(yōu)先選擇的藥物[9]。約5%的NSCLC患者存在ALK融合基因，治療上可選擇一代克唑替尼，二代艾樂替尼、色瑞替尼及布加替尼或三代勞拉替尼，針對合并LM的患者，艾樂替尼由于擁有相對更好的中樞控制率因而作為優(yōu)選藥物[3]。當(dāng)靶向藥物耐藥后，全身治療方面可嘗試全身化療、免疫治療，但由于血腦屏障的限制，效果均不太理想；局部治療可嘗試鞘內(nèi)化療及全腦放療，由于鞘內(nèi)大劑量多次注射化療藥物會產(chǎn)生較重的神經(jīng)系統(tǒng)毒性，而全腦全脊髓放射治療易伴發(fā)嚴(yán)重的骨髓抑制，且易引發(fā)高病死率[10]，因此兩者的臨床使用仍存在較大爭議。

TK Is治療一段時間后，常伴發(fā)著無法避免的耐藥問題，其主要原因是EGFRT790M等各種獲得性耐藥突變的出現(xiàn)。值得注意的是，多項研究[11,12]表明顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶和顱外轉(zhuǎn)移灶不同的基因突變情況。Nanjo等[11]研究發(fā)現(xiàn)在EGFR突變的LM患者中，出現(xiàn)TKI耐藥后重新進行基因檢測，T790M在肺組織中的突變率明顯高于CSF的突變率（55%vs8%）。此外Ruppert等[13]研究證實NSCLC患者的顱內(nèi)與顱外病灶對EGFR-TKI的藥物敏感性也不同。因此耐藥后再次明確中樞局部的基因突變狀態(tài)顯得尤為重要。

表 2 患者二代基因測序結(jié)果匯總Tab 2 A summary of NGS results

表 2 患者二代基因測序結(jié)果匯總（續(xù)表）Tab 2 A summary of NGS results (Continuted)

ctDNA是指來源于凋亡的腫瘤細胞或存活的腫瘤細胞分泌釋放出的DNA，其攜帶有原發(fā)灶的分子遺傳學(xué)特點[5,14]。相較于組織活檢，ctDNA液體活檢取材安全、便捷，可以準(zhǔn)確地檢測出多種耐藥基因。此外，靶向治療前后的ctDNA突變譜組和突變頻率的動態(tài)變化，可用于實時監(jiān)測藥物的療效，如敏感基因突變豐度降低，常提示較好的療效及預(yù)后；如豐度無明顯變化或升高，常預(yù)示著耐藥或復(fù)發(fā)[15-17]，且相較于影像學(xué)的復(fù)發(fā)評估，可提前約11個月，敏感性可達93%[18]。

由于血腦屏障（blood brain barrier, BBB）的限制，LM的特征性分子學(xué)標(biāo)志物難以進入血液循環(huán)，且外周血的ctDNA檢測結(jié)果中，腫瘤原發(fā)灶、其他顱外轉(zhuǎn)移灶產(chǎn)生的ctDNA會對其造成一定程度的干擾，因此CSF樣本比血液樣本能更真實地反映LM突變情況[19,20]。已有研究[6,7]顯示CSF中的ctDNA含量比血漿中的含量更高，能更全面地表征顱內(nèi)腫瘤的基因組改變。因此本研究利用NGS技術(shù)檢測NSCLC患者CSF中的ctDNA，并對比了同期的血液樣本中的基因譜，結(jié)果顯示CSF樣本的靶基因突變檢出率和豐度均明顯高于外周血，雖然本研究樣本量較小，但是與既往的相關(guān)研究結(jié)果[6,19,21,22]擁有一致的趨勢，進一步證實了CSF中ctDNA檢測對于指導(dǎo)NSCLC伴LM患者治療的重要價值。

在本研究所有EGFR突變的患者中，發(fā)生TKI耐藥后CSF中T790M突變率低于顱外病灶的突變率，此結(jié)果與既往相關(guān)研究結(jié)果[23,24]一致。這可能是由于BBB在中樞形成了一個腫瘤細胞的“避難所”，限制了TKI的滲透，因而藥物導(dǎo)致的繼發(fā)性T790M耐藥突變相對較少。此外，有報道[25,26]證實在常規(guī)劑量的TKI耐藥后，增大劑量可有效控制顱內(nèi)的病灶。綜合以上的研究結(jié)論，中樞性的耐藥機制可能不同于其他病灶，主要原因并不是耐藥基因的產(chǎn)生，而是藥物無法在中樞達到有效的治療濃度。及時有效的明確中樞病灶的基因突變情況，可明確不同患者耐藥的真實原因，指導(dǎo)后續(xù)治療是增大TKI劑量還是更換種類，制定更為科學(xué)有效的治療方案。

圖 2 腦脊液及外周血中基礎(chǔ)突變的腦脊液豐度和血漿豐度Fig 2 Maximum mutation allelic fractions in CSF and plasma

圖 3 各個患者腦脊液樣本中檢測出的單核苷酸變異和拷貝數(shù)變異數(shù)目統(tǒng)計Fig 3 The number of SNV and CNV mutations in CSF

TP53突變也呈現(xiàn)較高的檢出率，多項研究[27,28]證實其是NSCLC的獨立預(yù)后因素，常提示較短的無進展生存期（progression-free survival, PFS）及總生存期（overall survival, OS）。其中的機制尚無定論，Hou等[29]發(fā)現(xiàn)TP53可降低中國NSCLC患者對TKIs的反應(yīng)性，可能與EGFR-TKIs的原發(fā)耐藥有關(guān)，進而造成預(yù)后不良。本研究中TP53腦脊液中的突變率略高于血液，因此推測其可能與LM的發(fā)生及耐藥相關(guān)，有待后續(xù)相關(guān)研究證實。

另外，本研究中發(fā)現(xiàn)了3例患者存在罕見的非經(jīng)典突變。No.10患者為EGFR第19外顯子非移碼缺失突變，突變型為T751_I759del，既往國內(nèi)外文獻中僅有過1例報道[30]。該患者的外周血及肺癌組織中檢測出了相同的突變類型，體現(xiàn)了CSF與其他組織類型的一致性。患者在多種TKIs及放療、化療的綜合治療下，OS達到51個月。No.16患者同時存在兩種非經(jīng)典ALK融合基因，CNTNAP5-ALK（C2:A20）和WDR43-ALK（Wintergenic:A20），且在初診及出現(xiàn)LM后復(fù)查均為相同的基因融合類型，既往文獻中沒有報道過類似的病例，雖經(jīng)積極的化療及靶向治療，但OS僅18個月，考慮該兩種融合基因可能與患者的耐藥性相關(guān)，相關(guān)可能的機制有待進一步的探索。No.18為ROS1突變的多發(fā)耐藥患者，是國內(nèi)外報道的首個同時存在CD74-ROS1、NF1突變的病例，研究[31]顯示兩種突變共同作用，可促使RAS及下游通路激活，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，從而導(dǎo)致患者對于多種靶向藥物的耐藥。后2例患者的特有突變都僅在患者的CSF樣本中檢測出來，進一步證實了腦脊液用于液體活檢的全面性和優(yōu)越性。

綜上所述，通過NGS液體活檢技術(shù)，檢測LM患者CSF中的ctDNA變化，相較于外周血，可以更加準(zhǔn)確、全面地反映出LM的真實基因突變狀態(tài)，在指導(dǎo)用藥、監(jiān)測耐藥、療效評估及預(yù)后判斷等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究樣本量有限，后續(xù)將進一步擴大樣本量驗證相關(guān)結(jié)論，并探索TKIs治療前后的ctDNA動態(tài)變化，以期為TKI耐藥后的治療提供依據(jù)，推進更加精準(zhǔn)的腫瘤個體化治療。

Author contributions

Li HY and Yin ZY conceived and designed the study.Li HY and Xie Y analyzed the data.Li HY, Xie Y, Lin YJ and Yu TTprovided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.