基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制

韓林靜 吳克亮 王宏波 肖慶華 張震 朱建宗 林曉生*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

2.深圳寶安第二人民醫(yī)院(集團(tuán))總醫(yī)院，廣東 深圳 518104

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨密度降低，引起骨脆性增加、易發(fā)骨折為特征的全身性代謝性骨病[1]。其發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)關(guān)系[2]。隨著人口老齡化程度的不斷加劇，OP在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為繼心血管疾病、糖尿病之后發(fā)病率排第三的慢性疾病。據(jù)相關(guān)研究[3]報(bào)道，我國40歲以上人群OP發(fā)病率約為25%，預(yù)計(jì)到2050年，我國OP患者將達(dá)到2.12億，嚴(yán)重影響我國人民的身體健康。

黃芪為常用補(bǔ)氣藥，性味甘微溫，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為“上品”，具有補(bǔ)正氣、壯脾胃等功效。OP的病位在腎、脾及經(jīng)絡(luò)，腎虛是發(fā)生OP的根本原因，脾虛是其發(fā)展的誘導(dǎo)因素。脾虛不能運(yùn)化水谷，水谷之精不能充養(yǎng)先天腎精，筋骨失養(yǎng)加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生。補(bǔ)脾益氣是防治骨質(zhì)疏松的基本法則之一，因此在OP的防治組方中，黃芪作為基礎(chǔ)藥物存在，據(jù)統(tǒng)計(jì)[4]，黃芪的組方使用頻率位列第三位。大量研究表明[5-10]，黃芪內(nèi)的活性成分能夠多通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，提高成骨細(xì)胞活性，并能通過雌激素通路抑制破骨細(xì)胞重吸收，改善骨質(zhì)疏松，但對于黃芪抗OP的具體機(jī)仍不十分明確。因此，對黃芪的有效成分、作用機(jī)制進(jìn)行微觀分析，將有利于黃芪的進(jìn)一步開發(fā)利用，也為從補(bǔ)脾法入手治療骨質(zhì)疏松癥提供可能的理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)是由英國的Hopkins在2007年提出的，其基本原理主要是通過高通量成分篩選、分子交換驗(yàn)證、結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)揭露并構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-基因-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，同時(shí)分析、預(yù)測藥物的可能作用機(jī)制，最終結(jié)合相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)?zāi)M預(yù)測的機(jī)制。該理念打破了傳統(tǒng)的“單個(gè)藥物-單個(gè)靶點(diǎn)-單個(gè)疾病”的思想，是一種先進(jìn)的、系統(tǒng)的研究思想。

1 材料與方法

1.1 黃芪成分及潛在靶點(diǎn)獲取

通過中藥藥理學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫 (traditional Chinese medicine system pharmacology,TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索黃芪的化學(xué)成分，按口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30及類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18進(jìn)行篩選[11-13]，并將篩選結(jié)果在TCMSP數(shù)據(jù)庫逐一進(jìn)行作用蛋白靶點(diǎn)預(yù)測提取。

1.2 靶點(diǎn)名稱標(biāo)椎化

將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選所得所有蛋白靶點(diǎn)名導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，設(shè)置物種為人類(Human)，篩選作用人類蛋白靶點(diǎn)名并轉(zhuǎn)換成標(biāo)椎的基因名。

1.3 疾病靶點(diǎn)獲取

通過GeneCards(https://www.genecards.org)及OMIM在線數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)，輸入“Osteoporosis”，“Osteopenia”進(jìn)行搜索與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因，設(shè)置關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)(Relevance score)≥10，結(jié)果導(dǎo)出為Excel文件。

1.4 抗OP活性成分篩選

將人類靶點(diǎn)的基因名與疾病相關(guān)基因名進(jìn)行對比匹配處理，共同靶標(biāo)結(jié)果就是黃芪治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，反向篩選出抗OP潛在活性成分，并使用R軟件(Version R x64 3.5.1)繪制維恩圖。

1.5 黃芪-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分、基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscope 3.7.0，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)代表疾病、藥物、靶點(diǎn)基因、活性成分；邊(edge)用來連接疾病與基因、基因與活性成分、活性成分與藥物的關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的大小與連接度值呈正相關(guān)關(guān)系。

1.6 蛋白靶點(diǎn)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)建立

將黃芪抗OP關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl，Version11.0)，設(shè)置物種為人類(Homo spaiens)進(jìn)行構(gòu)建，設(shè)置可信度為中等可信(medium confidence)，隱藏未連接的節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)數(shù)據(jù)庫保持系統(tǒng)推薦設(shè)置，進(jìn)行蛋白互作分析，獲取蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.7 GO生物過程與KEGG富集分析及通路建立

將關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，Version6.8)，選擇物種為人類(Homo spaiens)，進(jìn)行GO生物過程(gene ontology-biological process，GO-BP)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集，以P<0.05進(jìn)行靶基因篩選，分析黃芪發(fā)揮藥理作用的生物過程及主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 黃芪的主要成分及潛在靶點(diǎn)獲取

依據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的標(biāo)椎，篩選出黃芪的主要化學(xué)成分有20種，其中M374未匹配到到靶點(diǎn)，見表1。去除重復(fù)，共預(yù)測到潛在靶點(diǎn)218個(gè)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)椎基因名轉(zhuǎn)換后，共得到180個(gè)作用人類的基因靶點(diǎn)。通過Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫共檢索到與OP相關(guān)基因199個(gè)，相匹配映射得到黃芪抗OP靶點(diǎn)共22個(gè)，見圖1。

表1 黃芪的主要成分及其OB和DL值Table 1 The main components of Astragalus and its OB and DL values

圖1 黃芪靶點(diǎn)與OP靶點(diǎn)匹配維恩圖注：左側(cè)表示OP相關(guān)靶點(diǎn)，右側(cè)表示黃芪作用靶點(diǎn)，重合部分表示黃芪潛在抗OP 靶點(diǎn)。Fig.1 Venn diagram of the targets of Astragalus and OP matching

2.2 “黃芪-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪活性成分、靶點(diǎn)基因、疾病導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建黃芪-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖2，節(jié)點(diǎn)圖形大小與連接度值呈正相關(guān)，其中M098與20個(gè)靶點(diǎn)相連接,可能是黃芪治療OP最重要成分，M354、M378、M392、M417、M422均與4個(gè)及以上靶點(diǎn)連接，見表2。

2.3 PPI及Hub蛋白確定

將OP相關(guān)靶點(diǎn)基因?qū)雜tring在線數(shù)據(jù)庫，設(shè)置隱藏未連接的靶點(diǎn)，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。節(jié)點(diǎn)表示蛋白靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)間作用關(guān)系。包含節(jié)點(diǎn)22個(gè)，邊140條，連接度值平均為12.7。利用Cytoscape插件中Degree算法確定度值前6為Hub蛋白，其中IL6、ESR1、MMP9等13個(gè)蛋白度值均大于平均值，見表3。

2.4 GO-BP分析和KEGG通路建立及分析

GO-BP結(jié)果分析(圖4)顯示，22個(gè)靶點(diǎn)基因主要參與了transcription factor activity，RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding(轉(zhuǎn)錄因子活性,RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合，7個(gè)基因)、receptor ligand activity(受體配體活性，6個(gè)基因)、RNA polymerase II transcription factor binding(RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，5個(gè)基因)等多個(gè)過程；KEGG通路富集(表4)顯示在Rheumatoid arthritis(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)、IL-17 signaling pathway(IL-17信號通路)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路)、Osteoclast differentiation(破骨細(xì)胞分化)過程中，均有7個(gè)靶點(diǎn)基因參與。

圖2 “黃芪-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)注：圖中圓形代表疾病，六邊形代表靶點(diǎn)，三角形代表活性成分，菱形代表黃芪。Fig.2 "Astragalus-Ingredients-Targets-OP" Network

表2 黃芪治療OP的活性成分及潛在作用靶點(diǎn)Table 2 Active ingredients and key targets of Astragalus in treating OP

圖3 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein Interaction PPI Network

表3 蛋白互作網(wǎng)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果Table 3 Protein interaction network topology analysis results

圖4 黃芪抗OP生物過程圖注：僅顯示富集結(jié)果前20的過程。Fig.4 Astragalus anti-OP biological process diagram

表4 KEGG通路富集結(jié)果Table 4 KEGG pathway enrichment results

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”范疇，其發(fā)生主要與腎虛、脾虛、血瘀相關(guān)[14]。脾為后天之本，氣血生化之源，主肌肉，運(yùn)化水谷充養(yǎng)腎精，營養(yǎng)肌肉骨骼。脾虛合并腎虛時(shí)，后天不足，運(yùn)化無力，后天不能充養(yǎng)先天，加重骨骼失養(yǎng)，加速OP的發(fā)生。再有，脾虛則氣血生化無源，氣虛鼓動(dòng)無力致血瘀。血瘀的病理產(chǎn)物瘀血又會(huì)加重脾虛、腎虛，進(jìn)一步加重骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。因此，補(bǔ)脾益氣是治療骨質(zhì)疏松癥和預(yù)防骨質(zhì)疏松骨折的基礎(chǔ)。

本研究中篩選出20種黃芪化學(xué)成分，其中作用于骨質(zhì)疏松癥的活性成分有9種，分別是：quercetin(槲皮素)、kaempferol(山萘酚)、isorhamnetin(異鼠李素)、Jaranol、3,9-di-O-methylnissolin、formononetin、Calycosin、(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol、7-O-methylisomucronulato。槲皮素能夠與20個(gè)骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)相結(jié)合，多通路發(fā)揮抗OP效用。顧藝婧等[15]研究表明，槲皮素能夠抑制骨細(xì)胞衰老，提高骨小梁數(shù)量，從而達(dá)到治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果；另外槲皮素還能夠激活ERK磷酸化，從而使骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖過程的到促進(jìn)，發(fā)揮成骨作用[16]。山萘酚具有雌激素樣活性，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活化過程。研究[17]也證實(shí)山萘酚能夠體外提高成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖與分化過程。在促進(jìn)大鼠成骨分化，提高骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)的治療效果上要好于槲皮素[18]。異鼠李素也是黃芪抗OP重要成分之一，作用途徑是增加骨礦密度及體積，提高骨小梁厚度及數(shù)量，降低骨小梁間距，具有防止去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用[19]。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，靶蛋白之間是通過多途徑、相互調(diào)節(jié)、共同作用的過程，而非單獨(dú)發(fā)揮作用的作用機(jī)制。Hub蛋白是指高連通蛋白，是藥物發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL6是一種多效應(yīng)性細(xì)胞因子，能夠起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。通過對活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的研究[20]顯示，RA造成的骨質(zhì)流失，與循環(huán)中細(xì)胞因子水平升高有關(guān)，內(nèi)源性細(xì)胞因子(RANKL和IL6)可直接抑制成骨細(xì)胞增殖和分化，另外還能夠刺激破骨細(xì)胞形成。ESR1為雌激素受體α的編碼基因，是骨質(zhì)疏松雌激素通路上的重要靶點(diǎn)基因。ESR1可調(diào)節(jié)骨代謝和峰值的獲取，抑制骨丟失，在骨生長和骨量維持中發(fā)揮重要作用。雌激素受體與雌激素結(jié)合后，能夠激活破骨細(xì)胞下游信號通路Fas/ FasL，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]。另外ESR1基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥也有關(guān)[22]，原因是染色體6P25.1區(qū)上的某些基因型突變可能直接與骨形成有關(guān)；MMP9基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[23]顯示MMP9與骨量相關(guān)。MMP9基因缺失，可提高骨小梁連接密度，而MMP9高表達(dá)則呈現(xiàn)破骨細(xì)胞吸收能力增強(qiáng)，骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)。

GO-BP結(jié)果顯示黃芪抗骨質(zhì)疏松成分作用的靶點(diǎn)蛋白功能主要集中在RNA轉(zhuǎn)錄、配受體活性方面。異常的轉(zhuǎn)錄翻譯將導(dǎo)致下游編碼蛋白的變異及功能異常，使細(xì)胞內(nèi)外配受體結(jié)合障礙，不能發(fā)揮正常的生物功能。KEGG富集分析結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞分化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路和雌激素信號通路可能是主要作用通路?；诖?，筆者認(rèn)為黃芪抗骨質(zhì)疏松的主要作用機(jī)制就是以上過程。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路中，AP1可以通過RANKL/RANK通路影響破骨細(xì)胞分化過程,該通路是骨質(zhì)疏松的經(jīng)典過程，成骨細(xì)胞來源的RANKL可以與破骨細(xì)胞RANK結(jié)合，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化與成熟[24]。在破骨細(xì)胞分化通路中，黃芪可能是通過直接和間接兩個(gè)路徑。直接路徑中活性成分直接作用于特異性破骨細(xì)胞因子c-FOS,抑制破骨細(xì)胞分化[25]；間接路徑中作用于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄子PPARγ,PPARγ[26]可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致骨髓脂質(zhì)代謝紊亂，使間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化減少，破骨細(xì)胞分化成熟增多，兩者平衡被打破，發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此筆者認(rèn)為，黃芪在破骨細(xì)胞通路上可能是通過抑制PPARγ表達(dá)和增強(qiáng)c-FOS表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。IL-17信號通路中主要作用于AP-1、IL6、IL1β、MMP3、MMP9等因子，有雌激素參與誘導(dǎo)IL-17分化可能是骨質(zhì)疏松的新機(jī)制，雌激素能夠逆轉(zhuǎn)IL-17直接刺激成、破骨細(xì)胞的作用[27]，表現(xiàn)出破骨細(xì)胞成熟分化被抑制，受抑制的成骨細(xì)胞礦化被解除。Dixit等[28]的研究也證實(shí)，抗IL17抗體能夠增強(qiáng)骨骼再生，提高損傷部位成骨標(biāo)志物表達(dá)水平，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，在骨質(zhì)疏松性骨折中能促進(jìn)骨愈合及再生的潛力。AGE-RAGE信號通路中黃芪作用于IL1、IL6、MMP2、STAT1,3、AP1等因子，該過程可能是通過AP1參與的MAPK信號通路間接調(diào)節(jié)骨細(xì)胞發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)在一定的環(huán)境下可促進(jìn)骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的磷酸化，提高M(jìn)APK的蛋白表達(dá)，加速EPCs向成骨細(xì)胞分化，該成骨細(xì)胞的分化過程主要與MAPK通路中的p38和JNK相關(guān)[29]。MAPK通路還可參與消化系統(tǒng)的生物過程，具有保護(hù)胃粘膜上皮細(xì)胞的作用。另外，通路富集結(jié)果中Toll樣受體信號通路、炎癥性腸病通路，PI3K-Akt信號通路等與消化系統(tǒng)、脾臟相關(guān)通路的出現(xiàn)，可能是黃芪從脾治療骨質(zhì)疏松癥的重要證據(jù)。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，黃芪抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制是多成分、多分子、多路徑的共同作用、相互作用的復(fù)雜過程；不僅直接參與骨代謝，還間接通過消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等影響骨微環(huán)境，調(diào)節(jié)骨代謝，這也體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)整體觀念的理念。另外，大量文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果與本研究方法中的成分、靶點(diǎn)、通路相一致，也證實(shí)了本研究方法的可靠性。但是，本次研究結(jié)果中也顯示出很多未知的分子通路及作用機(jī)制，需要深入研究，這也為進(jìn)一步從補(bǔ)脾方向研究骨質(zhì)疏松癥提供了一定的參考。