經(jīng)線粒體途徑相關(guān)信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響

張騰 魏鶴翔 張永 吳定 張成俊*

1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是以骨微觀結(jié)構(gòu)改變、骨脆性增加、骨量減少為特征的全身代謝性骨質(zhì)病變。有關(guān)研究表明，老年人及絕經(jīng)后的婦女是骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群。目前全球多數(shù)國(guó)家已開始步入人口老齡化，因此研究有關(guān)骨質(zhì)疏松的微觀機(jī)制及防治藥物具有重大的臨床意義。

骨質(zhì)疏松主要受成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的凋亡或破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的增殖影響發(fā)生。導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡的途徑中，線粒體凋亡途徑是導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡的主要途徑。通過線粒體途徑及相關(guān)通路，可進(jìn)一步探明骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，便于更好的治療骨質(zhì)疏松。

1 線粒體凋亡途徑

線粒體是為細(xì)胞供能的主要細(xì)胞器，為細(xì)胞正常活動(dòng)供應(yīng)能量、傳遞信號(hào)，參與細(xì)胞凋亡等過程。線粒體通透性轉(zhuǎn)位孔(permeability transition pore，PT孔)的開放是引發(fā)線粒體凋亡途徑的主要原因，PT孔是由線粒體外膜上的陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)和線粒體內(nèi)膜上的腺苷酸轉(zhuǎn)位因子(adenine nucleotide translocator,ANT)等組成的。PT孔開放后，線粒體內(nèi)外膜通透性改變，電、化學(xué)梯度不能維持，跨膜電位ΔΨm下降，水分進(jìn)入內(nèi)膜，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹，釋放出膜間隙的細(xì)胞色素C(Cytc)、Smac蛋白(the second mitochondrial derived activator of caspase)和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis induce factor,AIF)[1-2]。

線粒體釋放出細(xì)胞色素C后，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子(apoptosis protease activating factor 1，ApaF-1)結(jié)合，位于細(xì)胞質(zhì)中的ApaF-1再與ATP結(jié)合改變構(gòu)象，招募caspase 9前體，caspase 9前體自我剪切活化為有活性的caspase 9蛋白，有活性的caspase 9進(jìn)一步激活caspase 3，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。caspase蛋白可激活CAD(caspase- activated Dnase)，CAD是核酸酶的一種，可引起細(xì)胞骨架蛋白和核酸水解，致使細(xì)胞凋亡[2]。

從線粒體釋放出來的凋亡誘導(dǎo)因子AIF，與細(xì)胞色素C和ApaF-1通過caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡有所不同，可直接進(jìn)入細(xì)胞核作用于核酸，在相關(guān)酶催化下引起DNA大規(guī)模斷裂和染色質(zhì)濃縮[4]。AIF可不用caspase蛋白引起凋亡[3]。

Smac蛋白位于線粒體膜間隙中，具有調(diào)控凋亡的功能。在線粒體收到凋亡信號(hào)時(shí)，Smac蛋白進(jìn)入胞質(zhì)與凋亡抑制蛋白結(jié)合，阻礙其與caspase家族蛋白的結(jié)合，從而起到促進(jìn)凋亡的作用[5，41]。Smac蛋白不能主動(dòng)引發(fā)凋亡，但能促進(jìn)凋亡。

在通過線粒體途徑凋亡的過程中，有一組BcL-2家族蛋白可以參與調(diào)控，按功能可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，促凋亡蛋白主要有Bax、Bak、Bid、Bik等，抗凋亡蛋白有BcL-2、Bcl-xl、Bcl-w等[7,42]。促凋亡蛋白主要通過增加VDAC通透性，抗凋亡蛋白通過與促凋亡蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相關(guān)位點(diǎn)或阻止促凋亡蛋白與相關(guān)位點(diǎn)結(jié)合來發(fā)揮作用[6]。

2 線粒體途徑相關(guān)信號(hào)通路

2.1 PI3K/Akt信號(hào)通路

PI3K(phosphatidylinositide 3-kinases)，是一種由調(diào)節(jié)亞基 p85 和催化亞基 p110 構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。Akt又稱蛋白激酶PKB(protein kinase B)是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，擁有PH結(jié)構(gòu)域。PI3K通路受細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞因子等信號(hào)刺激受體酪氨酸激酶(RTK)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)時(shí)，胞質(zhì)區(qū)酪氨酸殘基活化，p85亞基轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜內(nèi)表面，磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (phosphatidylinositol 4,5-diphosphate,PIP2)受p110磷酸化變?yōu)榱字＜〈?3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol3,4,5 -trisphosphate,PIP3)[8]，PIP3募集擁有PH結(jié)構(gòu)域的Akt至質(zhì)膜內(nèi)面，Akt的Thr308殘基被3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1(PDK1)磷酸化，Ser473殘基被哺乳動(dòng)物雷帕霉素目標(biāo)復(fù)合物(mTORC2)磷酸化，使得Akt被完全激活[9-10]。完全激活后的Akt可作用于GSK-3β、BcL-2家族蛋白、FoxO等的相關(guān)基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、生長(zhǎng)代謝[19,43]。PI3K信號(hào)通路的激活，促進(jìn)了成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物堿性磷酸酶ALP、BMP-2的表達(dá)，有利于成骨細(xì)胞的增殖分化[20]。Xue等[40]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天甙可以作用于地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞，可激活PI3K/Akt通路，降低了Bax、細(xì)胞色素C、cleaved caspase-3,、cleaved caspase-9的表達(dá)，同時(shí)提高了BcL-2和p-Akt的表達(dá)。

有研究[16]表明，在流體剪切力抑制TNF-α誘導(dǎo)的凋亡實(shí)驗(yàn)中，激活PI3K-Akt通路后，Akt活化后降低了caspase-3和Bim的表達(dá)，抑制了成骨細(xì)胞的凋亡。PI3K-Akt通路通過調(diào)控caspase、BcL-2家族蛋白的方法抑制凋亡。除此之外，PI3K還可通過磷酸化GSK-3β，促進(jìn)β-catenin的堆積，進(jìn)而增強(qiáng)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[21]，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

PI3K通路對(duì)成骨細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)增殖分化和抑制凋亡兩方面，在骨組織層面表現(xiàn)為促進(jìn)骨形成，增加骨量的作用。該通路對(duì)治療骨質(zhì)疏松方面具有重大意義，而Akt是該通路的核心靶點(diǎn)，故未來可研究作用于Akt的藥物來治療骨質(zhì)疏松。

2.2 MAPK信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一族高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，在細(xì)胞的許多生命活動(dòng)都起了重要作用。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)由MAPKKK、MAPKK、MAPK的三個(gè)核心激酶逐層級(jí)聯(lián)化反應(yīng)組成。其中MAPK信號(hào)通路主要有四種，以其組件命名為JNK通路、ERK5通路、p38通路、ERK1 /2通路[11]。

2.2.1JNK通路：Jun氨基末端激酶((c-Jun N-terminal kinase，JNK)是JNK通路的核心物質(zhì)，關(guān)鍵靶點(diǎn)。JNK的編碼基因包括三種：JNK1、JNK2、JNK3。JNK通路可由細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性物質(zhì)、電離輻射等激活，JNK通路激活順序一般為ASK1、MEKK1激活MKK4/7，MKK4/7又激活JNKS。JNKS又可以激活部分BcL-2家族成員以及提高早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子(early growth response 1，EgR-1)、基環(huán)氧酶2(cyclo-oxyge-nase-2，COX-2)、骨橋素和c-fos 的表達(dá)[32,44]。Chen[22]等的研究表明，補(bǔ)骨脂素可抑制JNK途徑，下調(diào)p-ASK、p-JNK、Bax的表達(dá)，上調(diào)BcL-2的表達(dá)來抑制成骨細(xì)胞凋亡。Guo等[28]的研究表明，通過LPS激活JNK通路，胞內(nèi)p-JNK水平提高，提升了Bad和caspase-3的表達(dá)，降低了BcL-2的表達(dá)，激活caspase-3，誘使成骨細(xì)胞自線粒體途徑凋亡。JNK不僅是線粒體途徑誘發(fā)凋亡的關(guān)鍵物質(zhì)，也可參與誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑導(dǎo)致凋亡。阻斷JNK通路可顯著抑制成骨細(xì)胞的凋亡，對(duì)治療骨質(zhì)疏松有積極意義。

2.2.2p38通路：激活p38通路的物質(zhì)與JNK相似，由炎性因子(TNFα，IL-1 或 IL-6)及應(yīng)激刺激(紫外輻射、熱或滲透性休克)等刺激。P38通路的激活途徑一般由Mlk1-3、MEKK1-4、TAK、ASK1 /2激活MEK3和 MEK6，再由MEK3和 MEK6進(jìn)一步激活P38。P38 激活后可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、ATF-2、Elk-1、MEF-2、Stat1、Max、p53 等[23]。Yu等[24]研究表明，地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的過程中，激活了p38信號(hào)通路，用葛根素抑制p38通路，降低p-p38MAPK的表達(dá)，可見caspase-3表達(dá)下調(diào)。此外，彭鎏[35]研究發(fā)現(xiàn)，激活的p38 MAPK可引起IκB激酶增加，激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bai等[38]研究表明，在體外用大劑量地塞米松處理成骨細(xì)胞，可引起ASK1和p38表達(dá)水平升高，激活p38通路，促使成骨細(xì)胞凋亡。由此可見，p38通路可以促使成骨細(xì)胞凋亡，抑制骨形成，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)展進(jìn)程。研發(fā)抑制p38通路的藥物有利于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松。

2.2.3ERK1/2通路：ERK1/2通路受細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、滲透壓等刺激激活，激活途徑是先激活Ras再激活Raf，Raf通過MEK1/2將信號(hào)傳遞給ERK1/2并激活ERK[11]。ERK使許多與胞質(zhì)胞膜相連的底物c-RaF-1、MEK和磷脂酶A2等磷酸化，且移入胞核可磷酸化一系列促使成骨細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子如ELK-1、SAP、AP-1等，促使細(xì)胞增殖[33]。HK等[25]研究表明，膠原蛋白水解物可誘使ERK1/2磷酸化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化增殖。給隨后建立了骨質(zhì)疏松模型的小鼠口服膠原蛋白水解物，小鼠腰椎骨密度上升。Li 等[34]的研究表明，激活ERK1/2后，BcL-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bax/BcL-2比值升高，促使細(xì)胞凋亡。因此，這一通路對(duì)成骨細(xì)胞的具體作用存在爭(zhēng)議，尚不明確。

2.2.4ERK5通路：ERK5信號(hào)通路可由高滲透壓、生長(zhǎng)因子、流體剪切力、氧化劑等激活。ERK5的激活途徑為激活MEKK2/3后，在通過MEK5激活ERK5。Bin等[27]研究表明，流體剪切力通過ERK5途徑抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，活化的ERK進(jìn)入胞核導(dǎo)致Bad磷酸化，p-Bad被胞質(zhì)中的蛋白阻隔，進(jìn)入不了線粒體。通過減少線粒體中的Bad，可以抑制其引起的線粒體途徑caspase-3的活化。此外p-ERK5還可激活 p-Akt，減少Bim 的表達(dá)，對(duì)抗TNF-α導(dǎo)致的凋亡[26]。有關(guān)研究往往通過ERK5通路對(duì)抗TNF-α等誘導(dǎo)的凋亡。見圖1。

2.3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

信號(hào)通路未被激活時(shí)，β-catenin被糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase -3β，GSK-3β)、Axin、蛋白激酶 1(casein ki-nase 1，CK1)、腺瘤病大腸桿菌(APC)、蛋白磷酸酶2 A(PP2A)等組成的蛋白復(fù)合體結(jié)合，使β-catenin被定向泛素化，從而被降解[13]。Wnt信號(hào)被激活時(shí)，與Frizzled和低密度脂蛋白相關(guān)蛋白(LRP5/6)等結(jié)合，蛋白復(fù)合體被磷酸化，招募Axin從而使GSK-3β與蛋白受體復(fù)合物分離[14]。β-catenin不能被失去了結(jié)合物的GSK-3β磷酸化，β-catenin堆積在細(xì)胞中，進(jìn)入細(xì)胞核后與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因 (如c-myc、Cyclin D1等) 的轉(zhuǎn)錄[12,45]。Kang[36]的研究表明，激活后的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使BcL-2轉(zhuǎn)錄上調(diào)，抑制caspase-8及caspase-3活性，抑制細(xì)胞凋亡。Wei等[29]在研究敲除了β-catenin基因的小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，激活β-catenin可抑制破骨細(xì)胞的分化。另有研究[30]表明，可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂肪來源的干細(xì)胞促使其向成骨細(xì)胞分化。Man等[39]研究發(fā)現(xiàn)，熊果苷可提高β-catenin和Runx2的表達(dá)水平，激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促使成骨細(xì)胞增殖分化。

圖1 成骨細(xì)胞內(nèi)各相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞因子經(jīng)線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡示意圖Fig.1 Schematic diagram of regulation of apoptosis by mitochondrial pathway in various related signaling pathways and cytokines in osteoblasts

激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的主要作用是促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[31]，抑制破骨細(xì)胞分化，且該通路促使成骨細(xì)胞增殖的作用較強(qiáng)，是影響骨量增減的關(guān)鍵通路。而影響該通路的開關(guān)因素，就是β-catenin的堆積程度。從這個(gè)角度研發(fā)針對(duì)調(diào)節(jié)β-catenin的藥物可以較好的調(diào)節(jié)骨量變化。

2.4 NF-κB信號(hào)通路

NF-κB是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子家族，P50、P52、REL、REL-A和REL-B組成了該家族。該家族成員除REL-B外，均可相互結(jié)合形成同二聚體或異二具體。REL-B只可以與p50或p52組成二聚體。通路未被激活時(shí)NF-κB通常與IκB結(jié)合形成復(fù)合物，使NF-κB失去活性。在細(xì)胞因子類(TNF-α、IL-1、IL-2)，病度感染及X射線及紫外射線等對(duì)細(xì)胞施加刺激后，以上刺激激發(fā)的第二信使促使IκB降解，NF-κB產(chǎn)生活性。激活的NF-κB轉(zhuǎn)移向核中，選擇上調(diào)NF-κB1(編碼plo5)、NF-κB2(編碼pl00)、p Rel、BcL-3 和 MAD3(編碼IκBα)等基因[18,46]。彭鎏[35]的研究表明，激活的NF-κB轉(zhuǎn)入核內(nèi)與Bax基因上的位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)Bax的表達(dá)，從而Bax/BcL-2比值上升，促使細(xì)胞凋亡。龐同濤[37]的研究也表明，NF-κB表達(dá)增加、通路激活，可使下游的BcL-2表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，抑制增殖。

經(jīng)典NF-κB通路的激活主要降低成骨細(xì)胞的代謝能力，還可通過阻礙Smad蛋白發(fā)揮作用來降低成骨細(xì)胞的增殖分化能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡為其次要作用。

3 小結(jié)與展望

綜上，本文介紹了線粒體途徑及相關(guān)信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響。其中，PI3K/Akt、ERK5、Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，JNK通路、P38、NF-κB通路抑制成骨細(xì)胞增殖分化。大多信號(hào)通路可直接調(diào)節(jié)線粒體途徑中的caspase、BcL-2家族蛋白等關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)，從而通過抑制凋亡來促使凋亡，還可通過調(diào)控細(xì)胞增殖分化過程中的關(guān)鍵物質(zhì)及其轉(zhuǎn)錄因子來影響成骨細(xì)胞。

當(dāng)前有關(guān)成骨細(xì)胞的研究，仍將細(xì)胞的增殖、凋亡等活動(dòng)籠統(tǒng)地劃分在三大途徑里。未來有關(guān)成骨細(xì)胞的研究應(yīng)更多側(cè)重于各途徑信號(hào)通路之間的聯(lián)系影響上，力求將影響成骨細(xì)胞增殖、凋亡的各物質(zhì)包容在一個(gè)統(tǒng)一的體系中。在相關(guān)疾病的治療上，深入研究不同藥物、激素、胞內(nèi)外因子作用于各通路關(guān)鍵靶點(diǎn)上的效果，將已有的科研成果轉(zhuǎn)化為臨床成果，以解決骨質(zhì)疏松等病癥的治療問題。