聚焦超聲抑制慢性單純性苔蘚大鼠外陰皮膚纖維化及其機制研究

劉 瑤 范藝巾 秦 溢 李成志

外陰慢性單純性苔蘚（vulvar lichen simplex chronicus，VLSC）是一種外陰慢性、炎癥性疾病，好發(fā)于中老年婦女，其發(fā)病機制尚不明確。病理特征為外陰皮膚表層鱗狀上皮增生，真皮淺層膠原纖維化。目前，臨床常用的治療方法包括藥物治療和物理治療。常規(guī)藥物治療過程漫長且易反復(fù)發(fā)作；物理治療雖然在一定程度上有效，但復(fù)發(fā)率較高［1］。與上述治療方法相比，聚焦超聲治療具有療效好、安全性高等優(yōu)勢，但目前關(guān)于聚焦超聲治療疾病的分子機制卻鮮有報道。研究［2-3］表明，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）在真皮層纖維化過程中發(fā)揮拮抗作用，可抑制真皮層纖維化進(jìn)程；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）可抑制相關(guān)纖維化的細(xì)胞凋亡，從而在Bcl-2/Bax信號途徑纖維化的過程中發(fā)揮重要的作用。本實驗通過建立VLSC 動物模型并進(jìn)行聚焦超聲治療，觀察聚焦超聲對大鼠VLSC 的治療效果，以及治療后大鼠外陰組織中TGF-β 和Bcl-2 的變化及真皮淺層膠原纖維化的程度，旨在探尋聚焦超聲治療VLSC的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物

健康雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，8～10周齡，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［動物使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003］。本實驗經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

二、實驗方法

1.動物模型的建立及分組：雌性SD 大鼠備皮消毒后，硬毛牙刷刷至大鼠外陰皮膚充血發(fā)紅。用勾線筆蘸0.5%二羥甲基丁酸（DMBA）丙酮溶液（美國Sigma公司）涂抹于外陰皮膚。每周一、三、五涂藥一次，連續(xù)12 周。取外陰活檢確定模型建立成功［4］的40 只雌性SD 大鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組各20 只。另取10只正常SD大鼠為空白對照組。

2.治療與干預(yù)方式：使用重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司海極星?CZF 超聲波婦科治療儀，治療參數(shù)：頻率8～12 MHz，焦距0～8 mm，功率0～50 W。經(jīng)1.0%戊巴比妥鈉腹腔麻醉SD 大鼠后，備皮消毒，治療區(qū)域涂超聲治療專用耦合劑。實驗組根據(jù)皮損的范圍、程度及局部對超聲輻照的反應(yīng)確定輻照時間，均采用單次治療的方式，治療平均劑量為194.216 J；治療頭緊貼大鼠外陰皮膚，勻速直線輻照，速度為（5～10）mm/s，一般治療60～80 s。對照組治療過程與實驗組相同，但儀器無功率輸出；均治療4 周?？瞻讓φ战M大鼠不做任何實驗處理。觀察并比較實驗組與對照組VLSC 大鼠外陰皮膚恢復(fù)情況。

三、觀察指標(biāo)

1.Masson 染色檢測膠原纖維密度：取待檢測的大鼠外陰皮膚組織切片，入重鉻酸鉀浸泡過夜，鐵蘇木素染液染色、麗春紅酸性品紅染色、磷鉬酸染色后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色；1%冰醋酸分化后透明封片。Masson三色染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）染色后真皮層膠原纖維呈藍(lán)色，IPP 6.0 軟件對切片的染色信號進(jìn)行光密度分析，計算真皮層膠原纖維的平均密度。

2.免疫組織化學(xué)檢測蛋白表達(dá)：取待檢測的大鼠皮膚組織切片，抗原修復(fù)后避光孵育25 min，3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min，先后滴加相應(yīng)的一抗和二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，DAB 顯色液顯色，復(fù)染、脫水封片。高倍顯微鏡（×400）下觀察，TGF-β 和Bcl-2 以細(xì)胞膜和/或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，獲得圖像采用軟件IPP 6.0 進(jìn)行光密度分析，平均光密度值代表蛋白表達(dá)的強度。

3.Western blotting 檢測蛋白表達(dá)：取保存于-80℃待檢測的大鼠外陰皮膚組織，研磨后加入勻漿液提取皮膚組織細(xì)胞漿或細(xì)胞核蛋白，蛋白樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離后將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，然后加入一抗（TBST 溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5%BSA）和相對應(yīng)的二抗（TBST 稀釋比例1∶3000），最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯像。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)或率表示，治療后治愈率比較行連續(xù)校正χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、聚焦超聲治療前后VLSC 大鼠外陰皮膚恢復(fù)情況

聚焦超聲治療4周后，實驗組70%（14/20）大鼠外陰皮膚恢復(fù)正常；對照組80%（16/20）大鼠繼續(xù)進(jìn)展為外陰低級別鱗狀上皮內(nèi)病變，僅10%（2/20）恢復(fù)正常。兩組治愈率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.604，P<0.05）。見表1。

表1 實驗組與對照組聚焦超聲治療前后VLSC大鼠外陰皮膚正常情況比較 只

二、經(jīng)聚焦超聲治療后各組大鼠真皮層膠原纖維密度比較

空白對照組與實驗組真皮層膠原纖維密度均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；實驗組與空白對照組膠原纖維密度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2和圖1。

三、經(jīng)聚焦超聲治療后各組大鼠外陰皮膚組織中TGF-β及Bcl-2蛋白表達(dá)比較

空白對照組和實驗組大鼠外陰皮膚中TGF-β 表達(dá)均高于對照組，Bcl-2 蛋白表達(dá)均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；實驗組與空白對照組大鼠外陰皮膚組織中TGF-β及Bcl-2蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2和圖2～4。

表2 各組大鼠外陰真皮淺層膠原纖維密度及TGF-β、Bcl-2蛋白平均光密度值比較（±s）

表2 各組大鼠外陰真皮淺層膠原纖維密度及TGF-β、Bcl-2蛋白平均光密度值比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05。TGF-β：轉(zhuǎn)化生子因子β；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2

組別空白對照組對照組實驗組F值P膠原纖維密度0.191±0.020*0.316±0.031 0.189±0.009*54.778<0.05平均光密度值TGF-β 0.974±0.104*0.372±0.039 0.947±0.090*84.639<0.05 Bcl-2 1.037±0.075*1.304±0.150 0.947±0.090*14.216<0.05

圖1 經(jīng)聚焦超聲治療后各組大鼠外陰真皮淺層膠原纖維Masson染色鏡下觀（×200）

圖2 經(jīng)聚焦超聲治療后，免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠外陰皮膚組織中TGF-β蛋白表達(dá)（×400）

圖3 經(jīng)聚焦超聲治療后，免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠外陰皮膚組織中Bcl-2蛋白表達(dá)（×400）

圖4 Western blotting 檢測各組大鼠外陰皮膚組織中TGF-β 及Bcl-2蛋白表達(dá)

討 論

VLSC 是外陰瘙癢常見的原因之一，其病因及發(fā)病機制尚不明確。聚焦超聲治療VLSC 因其有效性好、安全性高，目前在我國已廣泛用于治療外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變［5-6］。但關(guān)于聚焦超聲治療疾病的分子機制卻鮮有研究。本實驗旨在探討聚焦超聲治療VLSC的作用機制。

TGF-β 和Bcl-2 蛋白均在真皮層膠原纖維化的過程中發(fā)揮重要作用［2-3］。TGF-β 是一種多肽類細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成和抑制免疫反應(yīng)等作用。傷口修復(fù)過程中，TGF-β 通過減少炎癥因子細(xì)胞聚集和ECM 沉積，來平衡傷口修復(fù)過程中的ECM 合成和分解，這一過程不僅可以促進(jìn)傷口愈合，而且可以抑制疤痕形成和增生，同時可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）與基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-1（TIMP-1）之間的平衡，促進(jìn)MMP-2活性增加，使TIMP-1表達(dá)減少，從而加速ECM 的降解，使Ⅰ型膠原纖維明顯減少，抑制纖維化進(jìn)程［2］。本實驗經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，對照組VLSC 大鼠的外陰皮膚組織中TGF-β 表達(dá)明顯減少，其真皮層膠原纖維化明顯，真皮層膠原纖維密度增大；而實驗組大鼠表皮層由于抑制纖維化相關(guān)的TGF-β 蛋白表達(dá)增加，經(jīng)聚焦超聲治療后真皮淺層膠原纖維細(xì)胞密度較對照組明顯減少（均P<0.05），排列疏松。Bcl-2 蛋白家族的主要作用機制是抗細(xì)胞凋亡，主要通過線粒體外膜透膜化達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的，Bax為促細(xì)胞凋亡基因，具有拮抗Bcl-2的作用，兩者的比值是細(xì)胞凋亡的決定性因素之一。VLSC 動物模型外陰皮膚組織鱗狀上皮增生，上皮層細(xì)胞增多，因此Bcl-2 蛋白可能通過延遲細(xì)胞周期進(jìn)程，延長細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，同時也可能與ECM 的分泌增多有關(guān)。由于Bcl-2 與Bax 的相對比值決定細(xì)胞凋亡的敏感度，Bax 表達(dá)也是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，因此Bcl-2 蛋白通過Bcl-2/Bax 信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，在皮膚組織纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［3-4］。本實驗免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，對照組VLSC 大鼠外陰皮膚組織中Bcl-2 表達(dá)明顯增多，其真皮層膠原纖維化明顯，真皮層膠原纖維密度增大；而實驗組VLSC大鼠表皮層由于促維化相關(guān)的蛋白Bcl-2表達(dá)減少，經(jīng)聚焦超聲治療后真皮淺層膠原纖維細(xì)胞較對照組密度明顯減少，排列疏松。由此推測，聚焦超聲治療可能通過增加TGF-β蛋白及減少Bcl-2蛋白在其表皮層的表達(dá)，抑制真皮層膠原纖維增生。另外（均P<0.05），本實驗也證實了VLSC 大鼠經(jīng)聚焦超聲治療后真皮淺層膠原纖維化程度減弱，其恢復(fù)程度接近于正常皮膚組織。

綜上所述，聚焦超聲治療可通過影響外陰皮膚組織中TGF-β 和Bcl-2 的表達(dá)，抑制真皮淺層膠原纖維化，從而達(dá)到治療VLSC大鼠疾病的目的。