基于RNA 的生物防治
——一種作物保護(hù)新模式

Mtthew Brmlett *, Geert Pletinck Peter Mienfisch *

a Syngenta Ghent Innovation Center, Gent 9052, Belgium b Syngenta Crop Protection AG, Basel CH-4002, Switzerland

1. 引言

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)企業(yè)在保障和提高食品、飼料、纖維和燃料的生產(chǎn)、質(zhì)量和數(shù)量方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。全球農(nóng)業(yè)企業(yè)目前提供殺蟲劑、除草劑、殺菌劑和生物技術(shù)產(chǎn)品，并在研發(fā)方面進(jìn)行了大量投資，這有助于提高公眾對充足供應(yīng)高質(zhì)量食品和農(nóng)業(yè)可持續(xù)性的期望。該行業(yè)也在應(yīng)對各種全球性挑戰(zhàn)，如人口增長、熱量消耗增加、全球環(huán)境壓力增加、監(jiān)管環(huán)境的變化以及對現(xiàn)有活性成分（AI）和性狀的抗性發(fā)展。

近年來，人們?nèi)找鎿?dān)心化學(xué)農(nóng)藥對人類健康和環(huán)境造成影響，促使該行業(yè)尋求替代解決方案，從而對生物害蟲防治劑的需求增加[2?4]。2016年生物農(nóng)藥市場價(jià)值28.3億美元，預(yù)計(jì)到2022年將增至66.0億美元，在預(yù)測期內(nèi)復(fù)合年增長率（CAGR）為15.43% [5]。

生物制品主要類別有：

· 微生物，如細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物病毒或真菌，直接應(yīng)用于植物；

· 大型生物，通常是活的有機(jī)體，如有益的昆蟲和線蟲；

· 信息化學(xué)物質(zhì)，如信息素；

· 植物提取物。

除此之外，最近已經(jīng)確定了RNA干擾（RNAi）過程是一種非常有前景的方法，可作為化學(xué)和生物作物保護(hù)劑、植物保護(hù)劑的葉面噴霧、土壤或種子處理的補(bǔ)充。改良的品種、性狀以及化學(xué)、生物作物保護(hù)劑的正確組合是確保未來可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

2. RNAi 的技術(shù)背景

RNAi是一種自然機(jī)制，存在于所有真核生物（包括昆蟲）中，它受序列特異性靶向的驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)致信使RNA（mRNA）降解[6]。通常認(rèn)為RNAi是一種防御機(jī)制，可以抵抗病毒[7]以及影響基因組DNA完整性的可移動(dòng)遺傳因子（如轉(zhuǎn)座子）。RNAi途徑在許多生物體中也被用來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平[8,9]。自RNAi被發(fā)現(xiàn)以來，它已成為實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的工具，用于研究基因功能[10,11]。除了用于細(xì)胞和遺傳研究外，人們還強(qiáng)調(diào)了利用RNAi作為分子治療劑和作物保護(hù)劑的潛力[6,12?15]。在昆蟲體內(nèi)，RNAi過程是由與特定mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA（dsRNA）觸發(fā)的。dsRNA可以由細(xì)胞內(nèi)部合成，也可以是能被細(xì)胞吸收的外源RNA（圖 1）。接下來，dsRNA被一種名為DICER的核糖核酸酶切割成21～25 bp的短核苷酸片段。這些短的RNA片段即可觸發(fā)mRNA降解。這些小的RNA片段被進(jìn)一步整合到名為RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）的多蛋白復(fù)合物中，并被解離成單鏈。RNA雙鏈的一條鏈（引導(dǎo)鏈）與具有RNase活性的蛋白質(zhì)Argonaute結(jié)合，并通過同源堿基配對與互補(bǔ)靶mRNA結(jié)合，Argonaute切割結(jié)合的mRNA，導(dǎo)致其降解。由于整個(gè)過程依賴于精確的互補(bǔ)序列識(shí)別，因此只有與相關(guān)小干擾RNA（siRNA）同源的mRNA受到干擾，這體現(xiàn)了RNAi的高選擇性。在缺乏合適的mRNA的情況下，相應(yīng)蛋白質(zhì)的從頭合成停止，最終缺少蛋白質(zhì)導(dǎo)致生物體產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺陷表型。對于某些昆蟲物種，通過取食dsRNA即可觸發(fā)RNAi效應(yīng)，使相應(yīng)mRNA系統(tǒng)性降解，并導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物減少。在蛋白質(zhì)產(chǎn)物對昆蟲的生活力和生存至關(guān)重要的情況下，RNAi可導(dǎo)致昆蟲的發(fā)病或死亡，這是將dsRNA用于昆蟲防控和作物保護(hù)的指導(dǎo)原則。目標(biāo)基因能否適用于昆蟲防控，取決于其在重要代謝過程中的作用，以及對應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物在表達(dá)時(shí)的臨界閾值和半衰期。

3. 基于RNA 的解決方案在農(nóng)作物保護(hù)中的現(xiàn)狀

圖1. （a）RNAi的分子機(jī)理；（b）利用RNAi進(jìn)行昆蟲防治的原理。DICER：核糖核酸酶的名稱；RISC：RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體；siRNA：小干擾RNA。*：多核苷酸長度為21～24個(gè)堿基。

十多年來，RNAi在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可[17]。RNAi的早期應(yīng)用實(shí)例包括抗木瓜病毒[18]和抗李子病毒[19]的產(chǎn)生，以及遲熟番茄發(fā)育[20]。如今，許多學(xué)術(shù)團(tuán)體和農(nóng)業(yè)綜合企業(yè)，如先正達(dá)、拜耳、科迪華、巴斯夫等，正積極尋求RNAi在保護(hù)農(nóng)作物免受各種昆蟲侵害方面的成功應(yīng)用。盡管現(xiàn)如今在使人們理解這種方法的潛力和局限性方面取得了很大進(jìn)展，但是市場上與RNAi相關(guān)的產(chǎn)品數(shù)量十分有限。目前，殺蟲RNAi最先進(jìn)的應(yīng)用途徑（涉及商業(yè)部署和監(jiān)管評估）是通過基因修飾（GM），利用一個(gè)解除管制的轉(zhuǎn)基因作物，在植物體內(nèi)產(chǎn)生昆蟲特異性dsRNA作為PIP，特異性殺死玉米根蟲（CRW）和玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）。該產(chǎn)品名叫SmartStax Pro，它包含一個(gè)靶向Snf7基因的dsRNA，可減少高CRW密度下的根損傷并延長Cry3Bb1和Cry34Ab1/Cry-35Ab1的耐用性[21]，但是該產(chǎn)品尚未上市?？梢灶A(yù)期，在RNAi的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒂兄卮蟮母偁?，重點(diǎn)是具有巨大潛在市場規(guī)模的作物的害蟲，以抵消與解除轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管制有關(guān)的高開發(fā)成本和管理成本。

幸運(yùn)的是，dsRNA AI也可以在局部使用，隨后將在敏感性昆蟲中引發(fā)效應(yīng)[17,22]。一個(gè)關(guān)鍵的要求是昆蟲通過取食方式攝入AI，因?yàn)閐sRNA介導(dǎo)的控制可僅僅通過接觸途徑實(shí)現(xiàn)并未得到證實(shí)。因此，利用現(xiàn)有的農(nóng)事活動(dòng)對dsRNA AI進(jìn)行噴灑，使害蟲取食處理過的作物，是一種可行的控制昆蟲途徑。許多學(xué)術(shù)團(tuán)體、政府和工業(yè)企業(yè)都在采用這種方法[23]。這種方法的主要優(yōu)勢包括：能夠快速應(yīng)對不斷變化的蟲害壓力、具有解決重要但利基的市場問題的潛力、使得原本在某些作物中不可使用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)變得可行，以及降低當(dāng)前的監(jiān)管成本。

常見的一些害蟲種類對dsRNA介導(dǎo)控制的內(nèi)在敏感性差異很大，迄今為止，通過取食攝入AI來防控鞘翅目昆蟲，已得到最廣泛的驗(yàn)證和表征[17,24]，然而，在田間環(huán)境中通過局部施用而獲得的可處理性并不適用于所有甲蟲類物種。這種易感性的變化可能源于多種因素，包括行為、物理位置（如植物內(nèi)部或土壤中的幼蟲）以及昆蟲細(xì)胞對AI缺乏適量的吸收。在實(shí)驗(yàn)室和溫室條件下，半翅目昆蟲也表現(xiàn)出易感性[25,26]，且與鞘翅目昆蟲相比，可觀察到的反應(yīng)具有更大的變異性[27]。遺憾的是，鱗翅目昆蟲作為最具破壞性的昆蟲目之一，一直特別難以通過基于RNA的方法進(jìn)行控制。盡管許多文獻(xiàn)都已經(jīng)表明，RNAi介導(dǎo)的基因敲除是可行的，并且在某些情況下會(huì)導(dǎo)致害蟲的低死亡率[28]，但是dsRNA引發(fā)的反應(yīng)仍存在缺乏穩(wěn)健性和一致性等問題。由于可能存在潛在的解決這些問題的方案，所以鱗翅目昆蟲的防控仍然是一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域。通過嘗試應(yīng)用新的dsRNA方法防控這些昆蟲的報(bào)道出現(xiàn)了一定的規(guī)律性[29,30]。RNAi效應(yīng)特征不明顯的害蟲種類（相對較小的研究工作）包括臭蟲[31]、蚜蟲[26]和食草螨[32]。有趣的是，有報(bào)道稱：利用dsRNA開發(fā)了一種針對蜂寄生的瓦羅螨的控制程序[33]。

4. 基于RNA 的生物防治在農(nóng)作物保護(hù)中的優(yōu)勢和局限性

基于RNA的生物防治為農(nóng)作物保護(hù)提供了一種新穎的產(chǎn)品，與傳統(tǒng)的以化學(xué)品保護(hù)農(nóng)作物的方式不同，它們的巨大潛力來源于其他方式。正如上面提到的，與目前使用的農(nóng)作物保護(hù)產(chǎn)品相比，dsRNA防控提供了一種完全不同的作用方式，適合在有害生物綜合治理（IPM）中使用，以延遲或降低害蟲對現(xiàn)有化學(xué)治理方案產(chǎn)生的抗性。與傳統(tǒng)的保護(hù)農(nóng)作物的化學(xué)品類似，新型的基于RNA的生物防控方法將從這種IPM系統(tǒng)中受益，因?yàn)樯锓揽責(zé)o法對耐藥性的發(fā)展產(chǎn)生免疫[34]。由于特定基因序列存在靶向性機(jī)制，使實(shí)現(xiàn)更高水平的選擇性成為可能，這與傳統(tǒng)化學(xué)防控的方法完全不同，甚至可實(shí)現(xiàn)對某種單一物種的選擇性控制，同時(shí)保持害蟲防治劑對來自密切相關(guān)屬的其他物種不起作用[如圖2所示，兩種鞘翅目害蟲——科羅拉多馬鈴薯甲蟲（CPB）和芥菜葉甲蟲（MLB）之間的選擇性]。這種選擇性，以及許多動(dòng)物對dsRNA普遍存在的攝取障礙，可能使基于RNA的生物控制有更具吸引力的安全性，并顯著降低包括有益昆蟲在內(nèi)的非靶標(biāo)生物（NTO）的風(fēng)險(xiǎn)。然而，這種高選擇性是有代價(jià)的，因?yàn)樗哂薪档凸逃杏泻ι镒V的潛在效果，這可能會(huì)限制可尋址的農(nóng)學(xué)用途。

圖2. RNAi選擇性設(shè)計(jì)示例。用兩個(gè)物種同時(shí)具有的一個(gè)保守靶基因的dsRNA片段處理了兩個(gè)親緣關(guān)系密切的葉甲CPB和MLB。單一片段僅在本地甲蟲中有效，而CPB和MLB片段的組合在兩者中均有效。

RNA分子是由多核苷酸組成的，具有不穩(wěn)定性，尤其在土壤等惡劣環(huán)境中，因此dsRNA是可生物降解的；分解產(chǎn)物（即單個(gè)核苷酸）大量存在于一切生物環(huán)境中，且長期以來被證明可安全食用。然而，當(dāng)針對這種惡劣環(huán)境中存在的有害生物時(shí)，這種極端的不穩(wěn)定性可能是一個(gè)嚴(yán)重的障礙，因?yàn)樗枰欢ǖ呐浞絹砥胶鈊sRNA最終被降解的不穩(wěn)定性和保持足夠的殺蟲活性。在較溫和的環(huán)境中，如在葉子表面，測試表明復(fù)配的材料在田間具有足夠的光穩(wěn)定性和耐雨水沖刷性，這為該產(chǎn)品的商業(yè)化提供保障。

dsRNA防控的下游產(chǎn)品PIP具有許多與它相同的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也受到與局部應(yīng)用dsRNA相同的許多限制，關(guān)鍵的區(qū)別來源于生產(chǎn)方式。最大的不同是，產(chǎn)生dsRNA分子的轉(zhuǎn)基因植物實(shí)際上將從其他系統(tǒng)存在中獲益，而目前為止，這是局部應(yīng)用dsRNA無法獲得的。這意味著AI不受農(nóng)作物環(huán)境中存在的許多降解因素的影響，并且在整個(gè)植物生命周期中可對其進(jìn)行保護(hù)，而無需噴灑農(nóng)藥。然而，這種方法同時(shí)也伴隨著巨大的挑戰(zhàn)。相對來說，最大的缺點(diǎn)是，添加劑和共制劑的存在可以使局部應(yīng)用的dsRNA受益，這些添加劑和共制劑旨在保護(hù)dsRNA免受核酸酶的影響[36,37]，這是解決具有高度降解的腸道環(huán)境的頑強(qiáng)害蟲的關(guān)鍵點(diǎn)，而且這也是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用不容易實(shí)現(xiàn)的。表1總結(jié)了基于RNA的治理方案在植物體內(nèi)與植物體外應(yīng)用的優(yōu)勢和局限性。

5. 基于RNA 的生物防治在農(nóng)作物保護(hù)中的應(yīng)用

目前，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界正在開展大量研究工作，以確定針對商業(yè)作物有害生物物種的基于RNA的控制方法[23]。本節(jié)示例了一些以RNA為基礎(chǔ)的生物防治CPB、CRW和SSB的最新研究進(jìn)展。

植物體外應(yīng)用基于RNA的生物防治的一般原理如圖3所示。將dsRNA生物防治產(chǎn)品噴到植物上；當(dāng)害蟲取食植物時(shí)會(huì)同時(shí)攝入防治產(chǎn)品，并被害蟲的細(xì)胞吸收。一旦進(jìn)入細(xì)胞， RNAi過程就會(huì)被觸發(fā)來阻止目標(biāo)害蟲中必需蛋白質(zhì)的合成，最終在害蟲對作物造成過多損害前控制它。一旦害蟲得到控制，這種植物就會(huì)成熟，并生產(chǎn)作物。如果設(shè)計(jì)強(qiáng)調(diào)選擇性，基于RNA的生物防治還可以降低對非目標(biāo)昆蟲的威脅（圖3）。

5.1. 對于 CPB 的防治

CPB (Leptinotarsa decemlineata)是一種受到廣泛關(guān)注的害蟲。這種以馬鈴薯為食的貪婪害蟲是通過基于RNA的生物防治進(jìn)行控制的理想物種，因?yàn)樗鼘NAi效應(yīng)具有高度敏感性和有效性。CPB幼蟲和成蟲棲息于植物表面，并損害這些植物，好在葉面易于處理，且容易被食用。通過實(shí)驗(yàn)室水平的檢測（包括體外和植物體上）得到害蟲死亡率和植物保護(hù)情況，結(jié)果表明，上述特點(diǎn)使生物防控非常有效。先正達(dá)公司內(nèi)部對此實(shí)驗(yàn)做了進(jìn)一步的研究，并已成功地將這種實(shí)驗(yàn)室水平的害蟲防治轉(zhuǎn)化為田間防疫，如圖4所示。

用田間試驗(yàn)中使用的對CPB有效的dsRNA進(jìn)行NTO篩選，結(jié)果顯示了極好的安全性和靶標(biāo)選擇性（圖 5）?？梢詮囊韵戮W(wǎng)站訪問對CPB有效的dsRNA方法的數(shù)據(jù)集：http://opendata.syngenta.agroknow.com/rna。

5.2. 對于 CRW 的防治

先正達(dá)公司還在努力將CPB研究計(jì)劃的成果擴(kuò)展到其他害蟲，雖然針對CRW的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用正在積極進(jìn)行（目前有一種產(chǎn)品上市），但在某些市場和地區(qū)（如歐洲），可噴灑的應(yīng)用方法可能會(huì)更有利?；赗NA的土壤害蟲生物防治面臨著嚴(yán)峻的土壤環(huán)境挑戰(zhàn)。如果要與目前市場上銷售的化學(xué)藥品的功效相當(dāng)，RNA防治劑必須在原地維持?jǐn)?shù)周的生物有效性。但是，土壤中的生物環(huán)境含有大量的微生物和核酸酶，可導(dǎo)致未受保護(hù)的dsRNA迅速降解。先正達(dá)公司利用其在AI制劑中的經(jīng)驗(yàn)來提高dsRNA生物防治在惡劣環(huán)境中的穩(wěn)定性，從而顯著改善了AI在土壤中的穩(wěn)定性，如圖6所示。

表1 基于RNA的治理方案在植物體內(nèi)與植物體外應(yīng)用之間的優(yōu)缺點(diǎn)

圖3. 基于RNA的生物防治在作物保護(hù)中的應(yīng)用。

圖4. 2015年，通過局部應(yīng)用dsRNA來防治CPB的田間試驗(yàn)。馬鈴薯田遭受CPB的嚴(yán)重侵害。與化學(xué)控制標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)纳虡I(yè)化合理應(yīng)用以保護(hù)植物。（a）基于RNA的生物防治處理試驗(yàn)田；（b）附近未經(jīng)處理的對照試驗(yàn)田。

圖5. 在CPB上測試的CPB dsRNA對其他昆蟲物種和益蟲的選擇性示例。*：文獻(xiàn)中顯示的對dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾有反應(yīng)的物種。

5.3. 對于 SSB 的防治

另一個(gè)研究項(xiàng)目的防治目標(biāo)是大豆臭蟲，已證實(shí)大豆害蟲對dsRNA生物防治具有先天的易感性，然而在生物學(xué)和進(jìn)食行為方面，也明確了需要克服的特定挑戰(zhàn)。為了確保大豆害蟲可以經(jīng)口攝入防治藥品，dsRNA必須在害蟲產(chǎn)生的大量的唾液核酸酶中存活[38]，且刺吸式口器害蟲（如臭蟲）與咀嚼式口器害蟲（如CPB）相比，本身取食的含噴灑藥物的葉片較少，綜合以上事實(shí)考慮，在這些條件下引發(fā)RNAi效應(yīng)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。這是先正達(dá)公司應(yīng)用配方專業(yè)知識(shí)以提高基于RNA的生物防治的穩(wěn)定性和可用性的另一領(lǐng)域。我們嘗試用特定dsRNA處理大豆植物，以保護(hù)其免受臭蟲之類的害蟲的侵襲，如圖7所示。

圖6. 未受保護(hù)（a）和受保護(hù)（b）的dsRNA靶向防治CRW的生物測定。每株植物都有CRW幼蟲，并在相同條件下培育。通過多種施用率測試，結(jié)果表明：dsRNA在檢測期間全程保護(hù)植物。配方的dsRNA對降解具有保護(hù)作用，因而防治作用更強(qiáng)。

6. 總結(jié)與展望

最近的研究表明，基于RNA的生物防治正在成為現(xiàn)有作物保護(hù)庫中極有價(jià)值的新興方式。它們具有獨(dú)特的作用方式，可以通過基因改造和生物防治兩種方法實(shí)施，且有望在IPM系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，這一點(diǎn)已通過解除管制和銷售首個(gè)基于RNA的玉米PIP商品得到了明確的證明。隨著監(jiān)管機(jī)構(gòu)和社會(huì)施加越來越大的壓力，以反對現(xiàn)有的廣譜化學(xué)防治，這種發(fā)展對于農(nóng)戶來說，是一個(gè)巧合的機(jī)遇。人們期望未來的殺蟲劑具有選擇性和可持續(xù)性，而基于RNA的AI滿足了這種要求，由于它們利用了自然過程來發(fā)揮控制作用，并且具有極高的選擇性，從而降低了NTO的風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)現(xiàn)基于RNA的產(chǎn)品的推廣及其廣泛使用和應(yīng)用的道路上，仍然存在許多挑戰(zhàn)，包括與傳統(tǒng)化學(xué)藥品防控相比，基于RNA的產(chǎn)品控制速度相對較慢，以及在不同蟲害群體中響應(yīng)水平的變化等。盡管近年來取得了長足進(jìn)步，但具有成本效益的大規(guī)模生產(chǎn)仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，具有成本效益的大規(guī)模生產(chǎn)仍然是一個(gè)難題。然而，可以預(yù)期的是，基于RNA的AI將成為有極高價(jià)值的新工具，以補(bǔ)充當(dāng)前的農(nóng)作物保護(hù)解決方案庫。

圖7. 大豆植株經(jīng)靶向臭蟲類害蟲的特異性dsRNA生物防治（a）和陰性對照dsRNA序列（b）處理。用成蟲和各個(gè)生長階段的幼蟲感染植株，并在相同條件下培育，進(jìn)行生物防治后的植物明顯生長得更好。

Acknowledgements

The authors would like to thank Pat Bauman, Mike Bean, Andrea Burns, Sonia Herrero, Duncan Oliver, Katja Schlink, Elke Schmidt, and Jason Vincent for reviewing the manuscript and for the stimulating discussions.

Compliance with ethics guidelines

Matthew Bramlett, Geert Plaetinck, and Peter Maienfisch declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.